1、目的：為探討催乳素／催乳素受體(PRL／PRLr)介導(dǎo)的免疫應(yīng)答機(jī)制，本課題研究PRL對(duì)免疫應(yīng)答基本過(guò)程的影響并對(duì)信號(hào)傳導(dǎo)途徑進(jìn)行了整體性分析，前者進(jìn)行三方面試驗(yàn)，既分別測(cè)試催乳素刺激前后T細(xì)胞活化所需第二信號(hào)共刺激因子CDl54和CD28水平、細(xì)胞增殖能力及其免疫效應(yīng)分子IFN-Y／IL一4分泌模式，后者通過(guò)蛋白組學(xué)分析，試圖了解催乳素在免疫細(xì)胞中的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)。 方法：實(shí)驗(yàn)一應(yīng)用不同劑量的重組人催乳素(rhPRL)和植物血凝

2、素(PHA)單獨(dú)或聯(lián)合刺激人T淋巴白血病細(xì)胞株JurkatDl．1細(xì)胞，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面(CD154和CD28分子的表達(dá)量；對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)JurkatDl．1細(xì)胞表面CDl54和CD28分子的表達(dá)量進(jìn)行測(cè)定。應(yīng)用催乳素受體單克隆抗體(PRLrAb)阻斷催乳素的作用，分別比較JurkatDl．1細(xì)胞表面CDl54和CD28分子基礎(chǔ)表達(dá)量和rhPRL聯(lián)合PHA刺激組表達(dá)量在應(yīng)用PRLrAb前后其各自呈現(xiàn)的變化。同時(shí)應(yīng)用半定量RT一P

3、CR測(cè)定對(duì)照組、rhPRL聯(lián)合PHA刺激組和PRLrAb阻斷組JurkatDl．1細(xì)胞表面CD154和CD28分子mRNA的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)二應(yīng)用臺(tái)盼藍(lán)拒染法通過(guò)倒置顯微鏡進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)以及利用MMT比色法酶標(biāo)儀測(cè)定OD550，值來(lái)評(píng)估rhPRL對(duì)JurkatDl．1細(xì)胞增殖的影響。實(shí)驗(yàn)三應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)不同濃度rhPRL刺激JurkatDl．1細(xì)胞24小時(shí)后的細(xì)胞上清液中IFN—y和IL-4水平，并計(jì)算IFN-γ／IL

4、-4比值，籍此來(lái)反映Thl／Th2細(xì)胞因子平衡偏離的方向。實(shí)驗(yàn)四應(yīng)用磷酸化金屬親和層析法(PMAC)富集磷酸化蛋白并用單向凝膠電泳(1DE)分離，同時(shí)利用抗磷酸化酪氨酸抗體免疫沉淀法(IP)富集磷酸化酪氨酸，并用雙向凝膠電泳(2DE)分離。染色后通過(guò)凝膠掃描系統(tǒng)對(duì)不同組的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)或條帶進(jìn)行分析，應(yīng)用手工和自動(dòng)挖膠系統(tǒng)獲取差異的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)或條帶。酶解后通過(guò)質(zhì)譜分析并與蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行蛋白質(zhì)匹配鑒定，由此鑒定出參與催乳素在JurkatDl

5、．1細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)的信號(hào)分子。 結(jié)果：?jiǎn)为?dú)使用重組人催乳素(rhPRL)或者植物血凝素(PHA)并不能刺激Jurkatgl.1細(xì)胞表面CD154分子的表達(dá)，而在PHA誘導(dǎo)下rhPRL可以上調(diào)JurkatD1.1細(xì)胞表面CDl54分子的表達(dá)。這種效應(yīng)在rhPRL濃度介于12．5ng／m卜200ng／m1呈現(xiàn)劑量依賴(lài)趨勢(shì)，rhPRL濃度在200ng／ml時(shí)CDl54分子的表達(dá)量最高為(28．63±8．05)％，與基礎(chǔ)表達(dá)量(10．8

6、3±3．76)％比較差別有顯著性意義。應(yīng)用催乳素受體單克隆抗體(40ug／m1)阻斷催乳素的作用后，rhPRL(200ng／m1)聯(lián)合PHA組細(xì)胞表面CDl54分子的表達(dá)量從(46．60±M．8)％下調(diào)到(17．51±1．25)。％；而且基礎(chǔ)的表達(dá)量也從(21．37±7．38)％下調(diào)到(3．95±O．93)％，兩組差別在統(tǒng)計(jì)學(xué)上均有顯著性意義。半定量RT-PCR測(cè)定對(duì)照組、rhPRL聯(lián)合PHA刺激組和催乳素受體單克隆抗體組，細(xì)胞CDl5

7、4分子mRNA和內(nèi)參B—actinmRNA的灰度比值分別為0．2207±0．005l、0．4190±0．0687和0．0938±O．0220．，各組之間的差別統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著性意義。時(shí)效關(guān)系的結(jié)果提示細(xì)胞表面CDl54分子表達(dá)量從催乳素刺激后3小時(shí)就逐漸升高，12小時(shí)達(dá)到高峰，到48小時(shí)恢復(fù)接近基礎(chǔ)表達(dá)水平。流式細(xì)胞儀測(cè)定JurkatDl．1細(xì)胞表面CD28分子表達(dá)量和半定量RT一PCR測(cè)定CD28分子mRNA表達(dá)水平，結(jié)果均顯示rhPR

8、L并不影響CD28分子的表達(dá)。rhPRL濃度在Ong／ml-100ng／ml之間，JurkatD1.1細(xì)胞計(jì)數(shù)從(2．50±O．25)×10。／ml逐步增加到(13．93±1．21)×10。／ml，相對(duì)應(yīng)的OD550，值從0．4643±O．0513逐步增加到1．2100±0．0183，呈現(xiàn)量效一致關(guān)系；IFN—γ劑量依賴(lài)性地從(34．34±0．47)pg/ml上升到(92．87±3．55)pg／ml，rhPRL濃度在100ng／ml-4

9、00ng／ml之間，各指標(biāo)無(wú)明顯差別。在不同濃度的rhPRL組之間IL一4的分泌量沒(méi)有明顯的改變。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白組學(xué)分析實(shí)驗(yàn)中，磷酸化金屬親和層析法獲得的磷酸化蛋白用idg分離，膠掃描分析發(fā)現(xiàn)對(duì)照組和rhPRL刺激組之間存在五條明顯差別的條帶，其中三條條帶在rhPRL刺激組，兩條在對(duì)照組。質(zhì)譜分析并與數(shù)據(jù)庫(kù)匹配，成功鑒定刺激組中一條條帶的蛋白質(zhì)，為熱休克蛋白90(Hsp90)。免疫沉淀獲得磷酸化酪氨酸，經(jīng)過(guò)2DE分離，膠掃描分析后挖取rh

10、PRL刺激組九個(gè)點(diǎn)，質(zhì)譜分析并與數(shù)據(jù)庫(kù)匹配，成功鑒定三個(gè)斑點(diǎn)的蛋白質(zhì)分別是核內(nèi)受體輔助抑制因子2變異體、半乳糖一卜磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)移酶和鋅指蛋白ZIM3。 結(jié)論：1、單獨(dú)應(yīng)用重組人催乳素刺激不能改變JurkatDl．1細(xì)胞表面共刺激分子CDl54的表達(dá)，只增加植物血凝素誘導(dǎo)下JurkatDl．1細(xì)胞表面CDl54分子的表達(dá)，提示催乳素對(duì)CD154表達(dá)僅為：誘導(dǎo)劑作用而非激活劑。這種效應(yīng)在超生理濃度催乳素刺激下明顯，呈現(xiàn)一定的劑量及時(shí)

11、間依賴(lài)效應(yīng)。2、內(nèi)源性和外源性的催乳素都會(huì)影響JurkatDl．1細(xì)胞表面CDl54分子的表達(dá)。3、JurkatDl．1細(xì)胞表面CD28分子的表達(dá)并不受內(nèi)源性和外源性催乳素的影響。4、單獨(dú)使用催乳素可以促進(jìn)JurkatDl．1細(xì)胞的增殖。5、催乳素促進(jìn)IFN-γ的分泌，促使Thl／Th2細(xì)胞因子向Thl細(xì)胞方向偏移。6、利用蛋白質(zhì)組學(xué)研究細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是一種可行方法，它可以整體性研究參與信號(hào)傳導(dǎo)的信號(hào)分子。7、催乳素可以上調(diào)磷酸化熱