1、研究背景和目的：
　　 原發(fā)性肝細胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC),是一種嚴重影響人類健康的惡性腫瘤。我國是世界上肝癌高發(fā)區(qū)之一,發(fā)病率為20.37/10萬,位于常見腫瘤的第3位。據(jù)2002年全球最新統(tǒng)計,肝癌發(fā)病率在常見癌癥中排行第6,而病死率則排第3位,每年發(fā)病人數(shù)為62.6萬例,新增5.7％,共有59.8萬例死亡,其中82％的病例在發(fā)展中國家,中國占55％。雖然目前臨床上可用于治療肝癌的手段

2、比較多,包括手術(shù)切除、肝移植、血管介入、消融技術(shù)、放化療等,且在肝癌的藥物治療上取得重大突破,但手術(shù)切除仍被公認為肝癌獲得根治的最好手段。然而,即使是根治性切除,5年內(nèi)仍有60～70％的病人出現(xiàn)轉(zhuǎn)移復發(fā),而局部治療的轉(zhuǎn)移復發(fā)率更高。如何預防腫瘤轉(zhuǎn)移復發(fā)已成為提高肝癌生存率的關(guān)鍵。因此,尋找預測腫瘤轉(zhuǎn)移傾向、判斷腫瘤預后的標志物,探索預防和治療的有效途徑,從而降低死亡率,提高肝癌患者的5年生存率,這是肝癌研究的重點內(nèi)容,也是腫瘤防治研究中

3、的一個難點。
　　 GPC3(Glypican-3,磷脂酰肌醇蛋白聚糖3,又稱MXR7、OCI-5、GTXR2-2)蛋白是硫酸乙酰肝素糖蛋白(Heparan sulfate proteoglycan,HSPG)家族中的一員。GPC3的突變導致細胞增殖和細胞凋亡失去平衡,可能是腫瘤發(fā)生的重要因為。GPC3還可結(jié)合肝素結(jié)合型蛋白如細胞粘附分子、基質(zhì)成分、生長因子、酶和酶抑制物,參與調(diào)節(jié)細胞增殖、分化、粘附和遷移等過程,還可能參與抑制

4、或調(diào)節(jié)大部分中胚層組織和器官生長的過程。目前研究發(fā)現(xiàn)GPC3參與Wnt、Hedgehog(Hh)、FGF、IGF、BMP、SMAD、TGF-β等多個與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的信號通路的調(diào)節(jié)。研究表明GPC3在肝細胞癌、大腸癌、惡性黑色素瘤、Wilm’s瘤、成神經(jīng)細胞瘤和肝胚細胞瘤高表達,而在肺腺癌、卵巢癌、乳腺癌、間皮瘤中表達顯著下調(diào),提示GPC3在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。
　　 RNA干擾(RNA interferenc

5、e,RNAi)是將與目的基因mRNA序列互補的小的雙鏈RNA導入靶細胞,促使mRNA降解,誘使細胞表現(xiàn)出特定基因缺失的表型,從而高效特異性阻斷體內(nèi)特定基因表達。其特征為:①RNAi是指通過反義RNA與正鏈RNA形成雙鏈RNA,特異性地抑制靶基因的現(xiàn)象,它通過人為地引入與內(nèi)源靶基因具有相同序列的雙鏈RNA(有義RNA和反義RNA),從而誘導內(nèi)源靶基因的mRNA降解,達到阻止基因表達的目的。②RNAi是指體外人工合成的或體內(nèi)的雙鏈RNA(d

6、sRNA)在細胞內(nèi)特異性的將與之同源的mRNA降解成21nt～23nt的小片段,使相應的基因沉默。③RNAi是將與靶基因的mRNA同源互補的雙鏈RNA(dsRNA)導入細胞,能特異性地降解該mRNA,從而產(chǎn)生相應的功能表型缺失,屬于轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默(post-transcriptionalgene silencing,PTGS)。④RNAi存在瀑布放大效應,每個細胞僅需幾分子siRNA就可產(chǎn)生RNAi效應,并可達到缺失突變體表型的程

7、度。相比普通siRNA,具有短發(fā)夾結(jié)構(gòu)的雙鏈RNA,穩(wěn)定性比siRNA更好,而且能延長目的基因沉默的時間。
　　 本研究擬應用RNA干擾技術(shù)將靶向GPC3基因的siRNA瞬時轉(zhuǎn)染肝癌離體細胞株huh-7,觀察GPC3基因表達沉默后對肝癌細胞株huh-7生物學特性的影響,初步探討GPC3基因在肝癌細胞增殖、凋亡、遷移中的作用。研究的目的在于給肝癌GPC3基因治療的可行性提供初步依據(jù)。
　　 方法
　　 設計靶向GP

8、C3基因的siRNA,瞬時轉(zhuǎn)染肝癌離體細胞huh-7,觀察GPC3基因的表達情況。
　　 1.siRNA的設計 應用siRNA設計軟件初篩出9對siRNA,再通過BLAST分析剔除與其他編碼基因有同源性的siRNA,最后經(jīng)RNA結(jié)構(gòu)分析軟件分析將對應的基因序列位于二級結(jié)構(gòu)的siRNA去掉,選出兩條對靶向GPC3的siRNA(包括GPC3-siRNA-1161、GPC3-siRNA-516)。
　　 2.瞬時轉(zhuǎn)染肝癌huh

9、-7細胞 采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將GPC3-siRNA轉(zhuǎn)染huh-7細胞,轉(zhuǎn)染48小時后進行相應檢測。
　　 3.各項指標的檢測 用real-time PCR技術(shù)檢測干擾后huh-7細胞的GPC3表達量,然后用Western-blot檢測干擾后GPC3的蛋白表達水平,AnnexinV-FITC/PI雙染經(jīng)流式細胞儀檢測細胞凋亡率,熒光顯微鏡觀察細胞形態(tài),MTT法檢測細胞增殖情況,劃痕實驗檢測細胞遷移情況。
　　 4.統(tǒng)計學方

10、法 應用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計學處理,計量資料以均數(shù)±標準差(x(_)±s)表示。MTT細胞增殖檢測、細胞凋亡檢測及細胞遷移實驗均采用析因設計方差分析比較各組間差異；P<0.05為有統(tǒng)計學意義。
　　 結(jié)果
　　 1.GPC3 mRNA表達的測定real-time PCR結(jié)果顯示,導入設計的siRNA(包括GPC3-siRNA-1161、GPC3-siRNA-516)的huh-7細胞GPC3表達水平為未轉(zhuǎn)染的hu

11、h-7細胞的0.56±0.07和0.10±0.06,P值:0.000,F值:257.640。
　　 2.GPC3蛋白的表達的測定Western blot結(jié)果顯示,GPC3-siRNA-1161組、GPC3-siRNA-516組、NC-siRNA-173組和NS組的GPC3蛋白相對表達量分別為0.51±0.06、0.15±0.05、1.08±0.04和1.03±0.01,P值:0.000,F值:314.814。
　　 3.

12、細胞凋亡率的測定 結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染72小時后GPC3-siRNA-1161組的細胞凋亡率為23.13±0.39％,GPC3-siRNA-516組細胞凋亡率為24.90±0.28％,均顯著高于未轉(zhuǎn)染的huh-7組的細胞凋亡率(12.24±1.23％)(P值:0.000,F值:139.553)。然而值得注意的是,轉(zhuǎn)染后96小時后兩干擾組與未轉(zhuǎn)染組間雖然仍有統(tǒng)計學差異,但差異已變小(GPC3-siRNA-1161組:28.11±0.12％,GPC

13、3-siRNA-516組:29.37±0.34％,未轉(zhuǎn)染組:25.87±1.85％；P值:0.029,F值:5.085)。
　　 4.細胞增殖的測定 結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染后48小時和72小時GPC3-siRNA-1161組和GPC3-siRNA-516組的活細胞數(shù)顯著低于未轉(zhuǎn)染組,以72小時最為明顯(GPC3-siRNA-1161組:0.962±0.025,GPC3-siRNA-516組:0.871±0.034,未轉(zhuǎn)染組:1.953±0

14、.043；P值:0.000,F值:819.992)。轉(zhuǎn)染96小時后,兩干擾組與未轉(zhuǎn)染組間的差異仍具有統(tǒng)計學意義,但已明顯變小(GPC3-siRNA-1161組:1.863±0.058,GPC3-siRNA-516組:1.816±0.052,未轉(zhuǎn)染組:2.842±0.013；P值:0.002,F值:294.267)。并且兩干擾組96小時的活細胞數(shù)較72小時增長超過2倍。
　　 5.細胞劃痕實驗檢測GPC3基因沉默后對肝癌細胞體外運

15、動遷移能力的影響。實驗結(jié)果顯示:不同時間點遷移細胞數(shù)有顯著性差異(F=1594.373,P=0.000)；GPC3-siRNA-1161組和GPC3-siRNA-516組細胞遷移數(shù)明顯低于NS組和NC-siRNA-173組,差異具有顯著性(F=125.549,P=0.000)；不同細胞在不同時間遷移細胞數(shù)有顯著性差異(F=24.233,P=0.000)。
　　 結(jié)論
　　 1.通過siRNA設計軟件初篩-BLAST分析-

16、RNA結(jié)構(gòu)分析軟件分析這3步進行siRNA設計,是一種快速、簡便、有效的方法。
　　 2.應用RNAi技術(shù),將靶向GPC3基因的siRNA轉(zhuǎn)染肝癌細胞(huh-7),能成功介導GPC3基因沉默,達到靶向封閉GPC3基因的目的。結(jié)果顯示,GPC3基因的沉默使huh-7細胞增殖及遷移能力下降、凋亡率增高。提示該基因在肝癌細胞生物學行為調(diào)控中可能起著關(guān)鍵作用,因而,以GPC3基因為靶基因的基因治療對肝癌可能有效。
　　 3.瞬