1、目的：構(gòu)建攜帶色素上皮衍生因子(pigment epithelium-derived factor，PEDF)基因的重組腺病毒，為進(jìn)一步基因治療脈絡(luò)膜新生血管(choroidalneovasculrization，CNV)奠定基礎(chǔ)。 方法：(1)從BN大鼠視網(wǎng)膜組織中提取總RNA。巢式RT-PCR擴(kuò)增PEDF基因cDNA，將PEDF克隆入T載體，行DNA序列分析。提取PEDF質(zhì)粒和腺病毒穿梭質(zhì)粒pDC316，以EcoR Ⅰ和Hi

2、nd Ⅲ進(jìn)行雙酶切，構(gòu)建重組腺病毒穿梭載體pDC316/PEDF，提取重組質(zhì)粒后以SacⅠ酶進(jìn)行酶切鑒定并進(jìn)行DNA序列分析。脂質(zhì)體法將pDC3 16/PEDF質(zhì)粒與腺病毒基因組骨架質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，利用Cre/loxp位點(diǎn)同源重組方法構(gòu)建重組腺病毒AdPEDF，行PCR鑒定后，大量擴(kuò)增并以氯化銫(Cesium chloride，Cscl)梯度法純化，并檢測重組腺病毒滴度。(2)檢測PEDF在真核細(xì)胞中的表達(dá)。以AdPEDF感染體外

3、培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞，1h后更換為等量無血清培養(yǎng)液，培養(yǎng)48h后收集上清，同時以未感染AdPEDF的HepG2細(xì)胞培養(yǎng)上清作為對照行Western blot檢測PEDF的表達(dá)。 結(jié)果：(1)基因測序結(jié)果表明，所克隆的PEDF基因包含了大鼠PEDF基因閱讀框內(nèi)的全部序列，與NCBI Sequence Viewer中公布的大鼠PEDF mRNA序列(NM-177927)完全一致。成功構(gòu)建了重組腺病毒穿梭載體pDC316/PEDF，測

4、序驗證了其可靠性，以其與腺病毒基因組骨架質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，應(yīng)用Cre/loxp位點(diǎn)細(xì)胞內(nèi)同源重組方法構(gòu)建AdPEDF，經(jīng)PCR鑒定證實(shí)重組腺病毒構(gòu)建成功。大量擴(kuò)增后進(jìn)行CsCl梯度離心純化，并行病毒滴度測定，滴度達(dá)3.08×10<'10>pfu/mL，滿足了體內(nèi)和體外試驗要求。(2)Western blot結(jié)果顯示感染組細(xì)胞上清液有PEDF的表達(dá)，對照組沒有PEDF的表達(dá)。證明AdPEDF能夠轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞使其表達(dá)PEDF，并分泌到細(xì)