1、目的： 組織工程骨作為大段骨缺損新的修復(fù)材料，已成為生物科學(xué)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)，種子細(xì)胞、支架材料、種子細(xì)胞與支架復(fù)合構(gòu)成了組織工程三大要素。其中，種子細(xì)胞的選取和獲得是骨組織工程的重要環(huán)節(jié)。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)具有易獲取、培養(yǎng)方便和多向分化的優(yōu)點(diǎn)，已成為骨組織工程的理想種子細(xì)胞。許多研究表明，由自體MSCs構(gòu)建的組織工程骨在動(dòng)物和臨床實(shí)驗(yàn)中取得了令人滿意的效果。然而自體MSCs

2、體外培養(yǎng)、誘導(dǎo)分化，最終構(gòu)建組織工程骨需要3-4周，難以用于急診骨缺損修復(fù)，限制了其臨床廣泛應(yīng)用，因此，探尋構(gòu)建可“隨取隨用”(off sheft)的組織工程骨，修復(fù)臨床各類(lèi)骨缺損是目前骨組織工程面臨的難題之一。 近年來(lái)研究表明，MSCs表面抗原主要為MHC-Ⅰ類(lèi)抗原，其免疫原性低，異體移植不易引起免疫排斥反應(yīng)。但經(jīng)過(guò)成骨誘導(dǎo)分化的MSCs其表面抗原向終極細(xì)胞表面抗原轉(zhuǎn)化，可能會(huì)引起免疫原性的升高。本實(shí)驗(yàn)采用近交系大鼠建模，探討

3、異基因MSCs免疫原性與成骨效應(yīng)，為異基因組織工程骨的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。 方法： 1．用全骨髓貼壁篩選法培養(yǎng)大鼠MSCs，并在倒置相差顯微鏡動(dòng)態(tài)觀察其生長(zhǎng)狀態(tài)。 2．用激光共聚焦顯微鏡和流式細(xì)胞儀鑒定MSCs表面抗原CD<,45>和CD<,44>。 3．用化學(xué)誘導(dǎo)培養(yǎng)劑對(duì)MSCs進(jìn)行成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)。 4．茜蘇紅染色、鈣染色及Ⅰ型膠原免疫組化等方法鑒定成骨細(xì)胞。 5．根據(jù)移植物的不同將18

4、只F344大鼠隨機(jī)均分為三組：A組，空白對(duì)照；B組，未誘導(dǎo)MSC；C組，誘導(dǎo)MSC，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)異基因：MSCs移植后大鼠外周血的CD<,4>和CD<,8>陽(yáng)性率。 6．用病理學(xué)方法觀察移植部位炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)情況。 ．采用靜止法體外構(gòu)建組織工程骨，并通過(guò)掃描電鏡技術(shù)觀察種子細(xì)胞在DBM上的黏附生長(zhǎng)情況。 8．用X線動(dòng)態(tài)觀察異基因MSCs構(gòu)建的組織工程骨的異位成骨效應(yīng)。 9．用分光光度計(jì)檢測(cè)外周血堿性磷酸

5、酶含量和組織病理學(xué)方法進(jìn)一步證實(shí)異基因組織工程骨的成骨能力。 結(jié)果： 1、全骨髓細(xì)胞貼壁篩選法適合大鼠MSCs培養(yǎng)。倒置顯微鏡觀察大鼠原代MSCs形態(tài)呈不規(guī)則，胞體較大，有細(xì)長(zhǎng)突起。 2、MSCs傳代培養(yǎng)至第三代，其CD<,44>陽(yáng)性率高于98％，CD<,45>陽(yáng)性率低于1.6％。 3、大鼠MSCs向成骨細(xì)胞方向誘導(dǎo)培養(yǎng)10-14d后，有鈣結(jié)節(jié)形成，茜蘇紅染色和Ⅰ型膠原免疫組化呈陽(yáng)性。 4、異基因

6、MSCs移植后，大鼠外周血CD<,4>和CD<,8>淋巴細(xì)胞亞群陽(yáng)性率，2周時(shí)開(kāi)始升高，4周達(dá)到鋒值，MSCs未誘導(dǎo)組的CD<,4>陽(yáng)性率為43.32％，CD<,8>陽(yáng)性率為43.72％，成骨誘導(dǎo)組CD<,4>陽(yáng)性率為49.72％，CD<,8>陽(yáng)性率為47.99％。 5、組織病理切片觀察各組均未見(jiàn)明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。 6．大鼠MSCs與DBM共培養(yǎng)7d后，見(jiàn)DBM的孔隙內(nèi)和孔隙周?chē)鶆蚍植驾^多的MSCs，兩者之間具有良好的

7、生物相容性。 7、異基因組織工程骨移植后X線動(dòng)態(tài)觀察：6周各組均未見(jiàn)成骨影，12周時(shí)實(shí)驗(yàn)組有云霧狀骨塊影像，邊界模糊，16周骨塊顯影較12周時(shí)明顯清晰。 8、組織病理學(xué)顯示：6周時(shí)有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)在DBM周?chē)?，未?jiàn)新生骨小梁。12周時(shí)炎癥細(xì)胞減少，有新生骨小梁形成，組織工程骨周?chē)薪Y(jié)締組織包裹，16周時(shí)骨小梁趨于成熟，炎癥細(xì)胞消失。 9、血清堿性磷酸酶檢測(cè)顯示：6周時(shí)實(shí)驗(yàn)組較空白對(duì)照組升高。12周，堿性磷酸酶含量較

8、六周時(shí)為高，達(dá)到9-9.25個(gè)金氏單位，16周，較12周無(wú)明顯變化。 結(jié)論：全骨髓貼壁篩選法培養(yǎng)的大鼠MSCs可達(dá)到實(shí)驗(yàn)需要純度，培養(yǎng)至第三代MSCs的CD<,44>的陽(yáng)性率達(dá)98％，CD<,45>陽(yáng)性率低于1.6％。經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)的MSCs顯示成骨細(xì)胞特性。成骨誘導(dǎo)的異基因MSCs引起外周血淋巴細(xì)胞亞群的增殖，較未誘導(dǎo)MSCs移植組高，提示誘導(dǎo)的MSCs較未誘導(dǎo)的MSCs的免疫原性強(qiáng)。由異基因成骨誘導(dǎo)的MSCs和未誘導(dǎo)后的異基因M