1、流行性乙型腦炎（簡稱乙腦）屬于黃病毒科，引起人類或馬的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染以及豬的流產(chǎn)，能通過持續(xù)感染的蚊子傳播給人，并且主要在脊椎動物宿主內存在，特別是具有較高病毒血癥的豬和鳥類，在人類乙腦主要引起致死率較高的腦炎，致死率從20-50％，但是絕大多數(shù)的幸存者都具有中樞神經(jīng)系統(tǒng)的后遺癥；在家養(yǎng)動物如豬和馬，主要引起腦炎，流產(chǎn)甚至死亡。與黃病毒科的其它成員類似，為單鏈正股RNA，長度為11kb，編碼一個含多聚蛋白的開放性閱讀框，這個多聚蛋白可

2、通過蛋白酶切割成至少11個蛋白，該病毒的結構蛋白包括衣殼蛋白，膜蛋白和囊膜蛋白，位于5’端三分之一的區(qū)域，而非結構蛋白從NS1到NS5位于閱讀框其余的區(qū)域。
　　 目前用于豬的乙腦疫苗包括弱毒苗和滅活苗，但是有關它們的安全性，生產(chǎn)和使用費用等問題越來越突出。WHO正在呼吁改善和研制新型乙腦疫苗，乙腦病毒的E蛋白與病毒和細胞受體結合，膜融合有關，也是引起中和抗體及宿主保護的主要免疫蛋白。結核桿菌熱休克蛋白70具有分子佐劑和載體效應

3、，是結核桿菌的主要抗原成分之一，可誘導和增強機體體液免疫和細胞免疫的發(fā)生，因此用該基因與一些傳染病或寄生蟲病病原體的抗原基因融合表達以制備疫苗，借助它的載體分子效應和佐劑作用，以提高病原體抗原的免疫原性和疫苗的免疫預防效果。
　　 本文將結核桿菌熱休克蛋白70與乙型腦炎E蛋白主要抗原片段在畢赤酵母中進行融合表達免疫小鼠，用以研究hsp70對免疫反應的影響，此外還對結核桿菌hsp70與抗原肽以何種方式共同作用才能發(fā)揮其佐劑效應進行

4、了研究，根據(jù)報道結核桿菌hsp70分為兩個區(qū)域，N末端為ATPase區(qū)，C末端為肽連接區(qū)，其中肽連接區(qū)為hsp70中真正行使佐劑功能的區(qū)域，因此本文將E蛋白主要抗原片段與肽連接區(qū)進行融合表達并免疫，研究肽連接區(qū)的分子佐劑功能；另外，將已報道的E蛋白上的中和表位與結核桿菌hsp70在大腸桿菌中融合表達，將其免疫效果與乙腦弱毒苗SA14-14-2進行比較.實驗結果如下：
　　 1，結核桿菌熱休克蛋白70及其功能域肽連接區(qū)對乙型腦炎E

5、蛋白主要抗原片段引起的免疫反應的影響。
　　 在本實驗室已構建的原核表達載體（含乙腦疫苗株SA14-14-2株E蛋白基因主要抗原片段）的基礎上用巴斯德畢赤酵母系統(tǒng)表達，該片段長1113bp，編碼371個氨基酸殘基，將其亞克隆入酵母表達載體pPICZα-A，以電穿孔法轉化酵母X-33，用Zeocin平板篩選重組子，經(jīng)甲醇誘導表達后，SDS-PAGE和免疫印跡分析表達產(chǎn)物。由于糖基化不同，所表達產(chǎn)物有兩種，其相對分子質量分別為44k

6、Da和50kDa，表達量較高，約為290mg/L，經(jīng)Western印跡驗證，有較好的抗原性。
　　 由于hsp70能增強與其融合的抗原肽的免疫反應，在本研究中還構建了一個在畢赤酵母中表達的重組載體，將乙腦E蛋白的主要抗原片段融合到結核桿菌hsp70的N末端，此外，已有報道hsp70C末端的肽連接區(qū)具有刺激Th1分化因子，C-C細胞分化因子產(chǎn)生以及佐劑作用，而N末端的ATP酶區(qū)（Hsp701-358）不能刺激產(chǎn)生任何細胞因子，根據(jù)

7、上述結論，我們同時構建了另一個融合表達載體，將乙腦E蛋白的主要抗原片段融合到hsp70肽連接區(qū)的N末端。將這兩種載體以電穿孔法轉化酵母X-33，每隔24h加甲醇誘導表達后，SDS-PAGE和免疫印跡分析表達產(chǎn)物。E-hsp70表達量約為33mg/L，E-Bindingdomain表達量約為97mg/L，經(jīng)Western印跡驗證，這兩種融合蛋白均有較好的抗原性。另外，在畢赤酵母中單獨表達了hsp70蛋白，表達量約為178mg/L。

8、　　 7-8周齡的BALB/C小鼠（均為雌性），分別在首免和首免后21天用PBS透析后的蛋白進行免疫，共分為七組，每組10只，分別以5.7μg（50pmol）的E-hsp70融合蛋白，3.4μg（50pmol）E-binding portion融合蛋白，3.5μg（50pmol）的hsp70，2.2μg（50pmol）的E蛋白主要抗原片段，3.5μg（50pmol）的hsp70與2.2μg（50pmol）的E蛋白主要抗原片段以1:1混

9、合以及首免用2.2μg（50pmol）的E蛋白主要抗原片段加上等體積的完全弗氏佐劑，二免加不完全弗氏佐劑。通過測定抗體滴度，淋巴細胞增殖，mIL-2和mIFN-γ的含量以及中和試驗表明E-binding portion與E-hsp70的免疫效果相近，這兩者均比E蛋白主要抗原片段單獨免疫效果好，但是這兩種融合蛋白的免疫效果均弱于E蛋白主要抗原片段加弗氏佐劑的效果，在E-hsp70融合蛋白免疫組中，抗JEV E蛋白主要抗原片段的IgG1和I

10、gG2a抗體滴度為1000.00和3981.07，這表明了該免疫反應為Th1反應型。
　　 2，結核桿菌熱休克蛋白70對乙腦E蛋白中和表位引起免疫反應的影響以及與乙腦弱毒苗SA14-14-2免疫效果的比較。
　　 根據(jù)大腸桿菌偏嗜性密碼子原則，人工合成了該中和表位，其上游酶切位點為BcoRⅠ，下游為HindⅢ，將該表位連接到原核表達載體pET-32a（+）上，命名為pet-32a-epitope，用PCR擴增hsp70基

11、因，將hsp70基因克隆入原核表達載體pet-32a-epitope的HindⅢ和XhoⅠ之間，從而得到融合表達載體pet-32a-epitops-hsp70，這兩種重組表達載體的表達在大腸桿菌BL21中，將含有重組質粒的大腸桿菌BL21在50mlLB37℃中培養(yǎng)，加入終濃度為100ug/ml氨芐青霉素，當菌液搖到OD600為0.6時，加入終濃度為1mMIPTG，在37℃中繼續(xù)搖14h，最后將大腸桿菌以6000rpm離心10min，用P

12、BS洗兩次，收集細菌，將其懸浮在PBS中，進行超聲波破碎，以10，000rpm離心20min，將上清和沉淀分別進行SDS-PAGE，確定蛋白在上清中還是包含體中，結果表明這兩種蛋白均以包含體形式存在，將包含體在8M的尿素中過夜溶解，然后將上清進行過柱。中和表位的分子量為24kDa，融合蛋白的分子量為94kDa，Western blot顯示這兩種蛋白均具有抗JEV的特異抗原性。
　　 為了評價發(fā)展一種有效的乙腦亞單位疫苗，以乙腦病

13、毒E蛋白上位于aa373-399的中和表位對小鼠進行腹膜內免疫，以及將該表位與結核桿菌hsp70在大腸桿菌中的融合表達產(chǎn)物免疫小鼠，根據(jù)大腸桿菌偏嗜性密碼子原則，人工合成了野毒株JaOArS982的中和表位并在大腸桿菌中表達，以該中和表位以及以白油作佐劑，融合蛋白及乙腦弱毒苗JEV SA14-14-2進行腹膜內免疫，融合蛋白免疫組產(chǎn)生了最高的抗中和表位抗體滴度并且其淋巴細胞增殖能力最強，排在第二位的是以白油作佐劑的中和表位，第三位是單獨