1、真姬菇（Hypsizygusmarmoreus）是一種珍稀食用菌，屬于中偏低溫型食用菌。菌絲生長(zhǎng)溫度5～30℃，最適20～25℃，超過35℃或低于4℃時(shí)菌絲不再生長(zhǎng)，在45℃以上無法存活，溫度過高或過低都會(huì)對(duì)真姬菇的生產(chǎn)造成較大影響。因此，真姬菇新品種（高抗菌株）培育成為真姬菇生產(chǎn)和科研中的一個(gè)重要課題。熱激蛋白(heatshockprotein，HSP)是一類在有機(jī)體受到高溫等逆境刺激后大量表達(dá)的蛋白，是生物對(duì)逆境脅迫短期適應(yīng)的必需組

2、成成分，對(duì)減輕逆境脅迫引起的傷害有很大的作用。熱激蛋白一旦在體內(nèi)形成，生物體就會(huì)盡快地適應(yīng)外界環(huán)境，表現(xiàn)出很強(qiáng)的抗逆性。因此，熱激蛋白基因是育種工作中具有重要實(shí)用價(jià)值的優(yōu)良基因。
　　 在本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)成功克隆出Hsp70基因（GenBank登錄號(hào)為GQ246176，全長(zhǎng)共2308bp，開放性閱讀框共2001bp，編碼666個(gè)氨基酸）的基礎(chǔ)上，本項(xiàng)研究構(gòu)建了Hsp70基因的真姬菇表達(dá)載體PHspHyg;然后將Hsp70基因轉(zhuǎn)入真姬

3、菇基因組中，成功獲得了轉(zhuǎn)Hsp70基因真姬菇菌株，并檢測(cè)出Hsp70基因在真姬菇中的高效表達(dá)。主要研究成果如下:
　　 1.以質(zhì)粒pROK2為出發(fā)質(zhì)粒，通過PCR擴(kuò)增出完整的Hsp70基因，并在其兩側(cè)加上KpnⅠ和XbaⅠ酶切位點(diǎn)，回收該片段后，將其插入質(zhì)粒pROK2的多克隆位點(diǎn)處，獲得重組質(zhì)粒PHsp;然后在此基礎(chǔ)上，限制性內(nèi)切酶HindⅢ和NheⅠ雙酶切重組質(zhì)粒PHsp，回收質(zhì)粒大片段，通過PCR將質(zhì)粒pCAMBIA1301

4、中的Hyg表達(dá)框完整擴(kuò)增出來，并在其兩側(cè)加上HindⅢ和NheⅠ酶切位點(diǎn)，回收該片段后，與酶切后質(zhì)粒PHsp的大片段相連接，獲得重組質(zhì)粒PHspHyg。成功構(gòu)建了Hsp70基因的真姬菇表達(dá)載體。
　　 2.通過對(duì)真姬菇的潮霉素抗性試驗(yàn)，確定了真姬菇G12的潮霉素致死濃度應(yīng)該在20μg/ml左右，據(jù)此將農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的初篩濃度定為20μg/ml，復(fù)篩濃度定為25μg/ml。通過Cefotaxime對(duì)真姬菇的毒性試驗(yàn)，結(jié)果表明，Cefo

5、taxime對(duì)真姬菇G12的菌絲生長(zhǎng)基本沒有影響，從而確定了Cef的最佳抑菌濃度為200μg/ml。
　　 3.本實(shí)驗(yàn)采取農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法將Hsp70基因真姬菇表達(dá)載體PHspHyg轉(zhuǎn)入真姬菇G12中，使得Hsp70基因表達(dá)框整合到真姬菇的基因組DNA中。通過對(duì)潮霉素抗性轉(zhuǎn)化子的驗(yàn)證，證明成功獲得了轉(zhuǎn)Hsp70基因真姬菇菌株。
　　 4.通過對(duì)已經(jīng)成功獲得的真姬菇轉(zhuǎn)化子菌絲，進(jìn)行45℃高溫不同時(shí)間的熱激處理試驗(yàn)，結(jié)果表明

6、，真姬菇轉(zhuǎn)化子的菌絲對(duì)高溫?zé)峒ぬ幚肀日婕Ч綄?duì)照組的菌絲有較好的耐熱性;SDS-PAGE電泳檢測(cè)高溫?zé)峒ぬ幚砗蟮恼婕Ч睫D(zhuǎn)化子的菌絲蛋白，結(jié)果表明真姬菇轉(zhuǎn)化子的蛋白在90KDa的表達(dá)量要大于對(duì)照組真姬菇，結(jié)果與我們預(yù)計(jì)的一樣。說明我們構(gòu)建的真姬菇轉(zhuǎn)化子可以提高熱激蛋白的表達(dá)量，增強(qiáng)真姬菇對(duì)高溫的應(yīng)激性。
　　 本試驗(yàn)研究結(jié)果對(duì)通過分子生物學(xué)技術(shù)提高食用菌對(duì)高溫的應(yīng)激性提供了良好的思路，對(duì)農(nóng)業(yè)栽培食用菌與現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合應(yīng)用有更好