1、MicroRNA（miRNA）是一類長(zhǎng)度約為21～24個(gè)核苷酸的非編碼小分子RNA。miRNA通過(guò)完全互補(bǔ)或部分互補(bǔ)方式識(shí)別靶基因3’-UTR，直接降解靶mRNA或抑制其翻譯，而抑制靶基因表達(dá)，調(diào)控細(xì)胞凋亡、增殖和分化。因此，miRNA在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起著重要的作用。
　　 miR-125a是miRNA家族成員之一，存在前體和成熟體兩種形式，其成熟體具有生物學(xué)活性。目前發(fā)現(xiàn)其有兩種成熟體miR-125a-3p與miR-125

2、a-5p。
　　 本課題組前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miR-125a-3p/5p在肺癌細(xì)胞中與HBE相比呈低表達(dá)，轉(zhuǎn)染正義miR-125a-3p/5p能使肺癌A549細(xì)胞內(nèi)miR-125a-3p/5p含量增加，促進(jìn)A549細(xì)胞凋亡，同時(shí)野生型p53表達(dá)也隨之升高，而轉(zhuǎn)染反義miR-125a-3p/5p則與之相反，但其調(diào)控機(jī)制尚不清楚。因此，我們認(rèn)為miR-125a-3p/5p可能通過(guò)調(diào)控野生型p53促進(jìn)A549細(xì)胞凋亡。
　　 利用多

3、種預(yù)測(cè)軟件通過(guò)對(duì)miR-125a-3p/5p可能作用的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，能抑制p53的癌基因MDM2可能是miR-125a-3p/5p的共同靶基因； Bcl-w基因可能是miR-125a-3p/5p共同靶基因、Bcl-2基因可能僅是miR-125a-5p靶基因。p53是目前研究比較深入的促凋亡因子；Bcl-w、Bcl-2是Bcl-2家族成員，二者均為凋亡抑制因子。因此，我們推測(cè)miR-125a-3p/5p可能是通過(guò)MDM2/p53、B

4、cl-w、Bcl-2途徑調(diào)控肺癌細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)將通過(guò)轉(zhuǎn)染正義或反義miR-125a-3p/5p增加或下調(diào)其在細(xì)胞內(nèi)水平，研究其對(duì)肺癌細(xì)胞表達(dá)MDM2/p53、Bcl-w、Bcl-2影響，進(jìn)一步揭示其調(diào)控凋亡的分子機(jī)制，為治療肺癌提供新的途徑。
　　 1、材料與試劑：
　　 材料與方法：人肺腺癌細(xì)胞A549、H1299（p53陰性）。
　　 成熟miR-125a序列：
　　 正義miR-125a-3p：5

5、’-ACA GGU GAG GUU CUU GGG AGC C-3’；
　　 反義miR-125a-3p：5’-GGC UCC CAA GAA CCU CAC CUG U-3’；
　　 亂序miR-1：5’-GGU CGG UGC UCG AUG CAG GUA A-3’；
　　 正義miR-125a-5p：5’-UCC CUG AGA CCC UUU AAC CUG UG-3’：
　　 反義miR-12

6、5a-5p：5’-CAC AGG UUA AAG GGU CUC AGG GA-3’；
　　 亂序miR-2：5’-GGA CGG CGA UCA GAU AAG AGU UC-3’；
　　 每個(gè)堿基都進(jìn)行了2’-0甲基化修飾以保持RNA序列的穩(wěn)定性，無(wú)熒光標(biāo)記。
　　 2、實(shí)驗(yàn)方法：
　　 2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：10％胎牛血清的DMEM（Gibco，USA）和RPMI-1640（Gibco，USA）培養(yǎng)，3

7、7℃、5％的CO2。
　　 2.2 Real time PCR：提取細(xì)胞總RNA，根據(jù)TaqMan（R）MicroRNA Reverse Transcription Kit（P/N：4366596，Applied Biosystems）試劑盒和TaqMan（）MicroRNA Assays HAS-MIR-125A（P/N：4380904，Applied Biosystems）按說(shuō)明書(shū)操作。所有反應(yīng)均設(shè)置三個(gè)復(fù)孔。
　　

8、 2.3 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染：培養(yǎng)細(xì)胞至亞融合狀態(tài)，轉(zhuǎn)染正義或反義miR-125a-3p/5p和亂序組miR-1/2溶液（20uM）LipofectamineTM 2000混合液加入到孔板中。37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)4-6小時(shí)后將培養(yǎng)基換液，根據(jù)需要培養(yǎng)24-72小時(shí)。
　　 2.4 RT-PCR：提取細(xì)胞總RNA，按RT-PCR（TaKaRa）試劑盒方法進(jìn)行反應(yīng)。PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，采用凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析。

9、
　　 2.5 Western Blot：采用考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行蛋白定量，ECL顯色。Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)采集，進(jìn)行灰度值測(cè)定，β-actin為內(nèi)對(duì)照，重復(fù)三次。
　　 2.6 流式細(xì)胞術(shù)（Annetin V-FITC雙染法）：每種細(xì)胞轉(zhuǎn)染后分成四組：空白對(duì)照組、加Annetin V組、加FITC組和加Annetin V+FITC組。在BD FACSCaliburTMFlow Cytometer（

10、BD Biosciences）上檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。
　　 3、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，對(duì)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用t檢驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，用mean±SD表示，P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果
　　 1、轉(zhuǎn)染正義或反義miR-125a-3p/5p對(duì)A549細(xì)胞中miR-125a-3p/5p表達(dá)水平和凋亡影響
　　 在A549細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染正義或反義miR-125a-3p/5p

11、，用亂序組和空轉(zhuǎn)染組作對(duì)照，轉(zhuǎn)染24h后，用Real-time PCR方法檢測(cè)miR-125a-3p/5p表達(dá)水平、用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡。結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染正義miR-125a-3p/5p組細(xì)胞中miR-125a-3p/5p表達(dá)水平和細(xì)胞凋亡率均比亂序組和空轉(zhuǎn)染組明顯增高（P<0.01）；轉(zhuǎn)染反義miR-125a-3p/5p組細(xì)胞中miR-125a-3p/5p表達(dá)水平和細(xì)胞凋亡率均比亂序組和空轉(zhuǎn)染組明顯降低（P<0.01）；亂序組和空轉(zhuǎn)

12、組與未處理組相比，miR-125a-3p/5p表達(dá)水平和細(xì)胞凋亡率均無(wú)明顯變化（P>0.05）。
　　 2、正義或反義miR-125a-3p/5p對(duì)A549細(xì)胞表達(dá)MDM2、野生型p53、Bcl-w和Bcl-2的影響
　　 在A549細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染正義或反義miR-125a-3p/5p 24h后，通過(guò)RT-PCR和Western Blot方法檢測(cè)MDM2、野生型p53、Bcl-w和Bcl-2等mRNA和蛋白表達(dá)情況。結(jié)果

13、顯示：正義miR-125a-3p/5p組細(xì)胞中p53 mRNA和蛋白表達(dá)升高，Bcl-w mRNA和蛋白表達(dá)降低，MDM2 mRNA無(wú)變化而蛋白表達(dá)降低，Bcl-2 mRNA和蛋白無(wú)變化；轉(zhuǎn)染反義miR-125a-3p/5p組細(xì)胞中p53 mRNA和蛋白表達(dá)降低，Bcl-w mRNA和蛋白表達(dá)升高，MDM2 mRNA無(wú)變化而蛋白表達(dá)升高，Bcl-2 mRNA和蛋白無(wú)變化。
　　 上述結(jié)果提示：miR-125a-3p/5p可能通過(guò)

14、抑制MDM2表達(dá)進(jìn)而上調(diào)p53表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡；或同時(shí)抑制Bcl-w表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞凋亡。
　　 3、阻斷p53或Bcl-w后，miR-125a-3p/5p對(duì)A549細(xì)胞凋亡影響
　　 為了明確miR-125a-3p/5p是否通過(guò)p53和/或Bcl-w途徑調(diào)控細(xì)胞凋亡，在轉(zhuǎn)染正義miR-125a-3p/5p同時(shí)用單克隆抗體封閉野生型p5324h；在轉(zhuǎn)染反義miR-125a-3p/5p同時(shí)用單克隆抗體封閉Bcl-w 24h，

15、用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡。結(jié)果顯示：正義miR-125a-3p/5p引起的細(xì)胞凋亡通過(guò)阻斷p53后受到不同程度的抑制（P<0.05），其中阻斷p53對(duì)正義miR-125a-5p引起的細(xì)胞凋亡抑制作用比miR-125a-3p顯著（P<0.05）；轉(zhuǎn)染反義miR-125a-3p/5p引起的細(xì)胞凋亡抑制通過(guò)阻斷Bcl-w后有不同程度恢復(fù)（P<0.05），其中阻斷Bcl-w對(duì)反義miR-125a-3p的作用比對(duì)反義miR-125a-5p的作用顯

16、著（P<0.05）。
　　 為了進(jìn)一步明確野生型p53和Bcl-W在miR-125a-3p/5p誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡中所起的作用是否不同，我們選擇p53陰性肺癌細(xì)胞系H1299，轉(zhuǎn)染正義和反義miR-125a-3p/5p 24h，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果顯示：正義miR-125a-3p比正義miR-125a-5p引起的細(xì)胞凋亡顯著增高（P<0.01）；反義miR-125a-3p比反義miR-125a-5p抑制細(xì)胞凋亡顯

17、著降低（P<0.05）。
　　 上述結(jié)果表明：miR-125a-5p可能主要通過(guò)調(diào)控MDM2/p53途徑促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而miR-125a-3p可能主要通過(guò)調(diào)控Bcl-w途徑促進(jìn)細(xì)胞凋亡。
　　 結(jié)論
　　 1、miR-125a-3p/5p可以通過(guò)抑制MDM2，上調(diào)野生型p53表達(dá)；同時(shí)抑制Bcl-w表達(dá)，促進(jìn)肺癌細(xì)胞凋亡。
　　 2、miR-125a-5p可能主要通過(guò)調(diào)控MDM2/野生型p53途徑促進(jìn)肺癌