1、隨著社會經(jīng)濟發(fā)展、醫(yī)療進步和教育水平明顯提高，世界人口老齡化問題日趨嚴重。WHO資料預計，到2025年全世界60歲以上老齡人口總數(shù)將超過12億。白內障作為一種常見的衰老相關疾病，發(fā)病率迅速上升，流行病學調查發(fā)現(xiàn)60歲以上老人中，96％可以發(fā)現(xiàn)晶狀體有不同程度或不同形式的混濁[1]。據(jù)專家預測，到2025年全世界將有4000萬人因白內障而失明，白內障嚴重損害患者視力，嚴重影響患者生活質量，必將造成衛(wèi)生資源和社會經(jīng)濟的沉重負擔。因此，白內障

2、已成為世界人口老齡化所面臨的最嚴峻問題之一。
　　目前手術仍然是治療白內障最有效的方法，但我國存在白內障患者數(shù)量龐大、患者對手術存在一定的恐懼心理、眼科醫(yī)療資源分布不均勻，以及白內障手術后調節(jié)能力重建、后發(fā)性白內障等問題。更嚴峻的是，白內障手術治療的巨大醫(yī)療支出問題。因此，揭示白內障發(fā)病的關鍵環(huán)節(jié)，探索一種經(jīng)濟有效且容易推廣的非手術防治新途徑，是應對我國人口老齡化的重要舉措，不僅具有重要的學術意義，而且具有潛在的應用前景和廣泛的社

3、會效益。
　　一直以來，白內障發(fā)病機制不明確已成為其非手術治療研究的瓶頸，以往有關白內障發(fā)病機制的研究，唯一達成共識的是晶狀體上皮細胞凋亡是非先天性白內障形成的共同細胞學基礎[2]，但具體機制尚不明確。近年來有關microRNA的研究為我們開拓了新思路。
　　微小RNA(microRNA，miRNA，miR)是一組全長大約21-25個核苷酸的單鏈小分子RNA，存在于植物和動物體的細胞中[3]。microRNA主要是通過與mR

4、NA的3'非翻譯區(qū)序列完全或不完全互補配對，引起靶mRNA的降解或翻譯的抑制[4]。據(jù)估計，在人類整個基因組中，有1/3的基因被microRNA調節(jié)[5]，目前已發(fā)現(xiàn)有大約一千種microRNA在人類基因組中表達。
　　microRNA與多種疾病包括眼部疾病的發(fā)生與發(fā)展密切相關[6-8]。在慢性丙型肝炎、肝癌、血脂異常等疾病中，microRNA在治療領域的研究已取得突破性進展，并相繼在nature，science，cell等期刊中

5、發(fā)表文獻報道[9-11]。最新研究證明microRNA在白內障的發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用[12,13]。Hughe[12]等研究發(fā)現(xiàn)miR-184的seedregion突變可以導致前極性白內障，Peng[13]等研究發(fā)現(xiàn)let-7b與年齡相關性白內障的嚴重程度和發(fā)病年齡有顯著關系等。
　　miR-125，是一種從線蟲到人類不同物種中高度保守的microRNA，被報道作為抑制物或促進物，與各種類型的癌癥和其他疾病密切相關[14]。mi

6、R-125在細胞分化、增殖、凋亡等許多不同的細胞過程中發(fā)揮關鍵作用，這些作用是通過靶向調控不同的轉錄因子[15]、基質金屬蛋白酶[16,17]、生長因子[18]以及其他可能導致異常增殖、侵襲和轉移、甚至癌癥的變異。此外, miR-125還在宿主的免疫防御，特別是細菌或病毒感染時的應答過程中發(fā)揮重要作用[14]。
　　然而，目前國內外microRNA在眼科領域的研究才剛剛起步，且多限于表達檢測，對microRNA靶基因的預測及功能驗

7、證研究甚少。其中，miR-125b在眼部疾病，特別是包括白內障在內的晶狀體疾病中的研究，目前國內外尚未見明確報道。本研究第一次發(fā)現(xiàn)了miR-125b在年齡相關性白內障中的重要作用，并進一步探索了miR-125b通過調控靶基因野生型p53從而影響人晶狀體上皮細胞凋亡的作用機制。
　　材料與方法:
　　一、組織標本
　　收集年齡相關性白內障（排除其他眼部疾?。┚铙w前囊膜的新鮮組織，標本來源于中國醫(yī)科大學附屬第四醫(yī)院眼科2

8、012年9月至2013年6月期間行超聲乳化白內障吸出術時收集撕囊的晶狀體前囊膜，患者簽署知情同意書。收集正常人晶狀體前囊膜標本，標本來源于中國醫(yī)科大學附屬第四醫(yī)院眼科眼庫提供意外死亡的新鮮人眼透明晶狀體組織。組織標本收集均通過倫理委員會批準，并根據(jù)赫爾辛基宣言的原則進行。
　　二、紫外線照射
　　利用紫外燈XX-15B（Spectroline，Westbury, NY, USA）進行照射，紫外線光譜在280-320nm之間，

9、峰值為312 nm。利用UVX-31傳感器(both UVP Inc.，SanGabriel，CA，USA)測量紫外線輻射強度和劑量(校準波長312nm)。
　　三、實時定量聚合酶鏈反應(RT-qPCR)
　　按照操作說明利用Trizol試劑提取新鮮組織和細胞系中的總RNA(Invitrogen，NY, USA)。RNA的質量利用紫外可見分光光度計(UV-1800)檢測。RNA的完整性利用1.5％瓊脂糖凝膠電泳驗證。所有樣品

10、OD260/OD280在1.8和2.0之間。
　　按照操作說明利用RT引物和TaqMan探針(Ribobio，Guangzhou，China)在ABI7500(Applied Biosystems，USA)中運行檢測miR-125b的表達，RNU6B作為內參對照。利用PrimerScript RT reagent kit(Takara，Dalian，China)合成cDNA，按照操作說明利用染料法在ABI7500(Applied

11、Biosystems，USA)中運行檢測p53的表達，β-actin作為內參對照。循環(huán)結束后作出溶解曲線保證產物的特異性，經(jīng)3次獨立實驗得到的數(shù)據(jù)利用公式RQ=2-△△Ct的方法進行分析。
　　四、細胞培養(yǎng)和轉染
　　人晶狀體上皮細胞系(SRA01/04)由遼寧省晶狀體學重點實驗室提供。SRA01/04細胞利用DMEM培養(yǎng)基（Gibco(@) Invitrogen，Carlsbad, USA），含有10％新生牛血清，100u

12、/ml的青霉素和100μg/ml的鏈霉素，在37℃，5％CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)。
　　按照操作說明利用Lipofectamine2000(Invitrogen，USA)作為轉染試劑，向細胞轉染miR-125b mimic，mimic control，inhibitor，inhibitor control(RiboBio,Guangzhou，China)，向細胞轉染p53 siRNA和陰性對照（GenePharma，Shangha

13、i，China)。48小時后，利用RT-qPCR方法檢測miR-125b的表達，利用RT-qPCR和Western blot方法檢測p53的表達，利用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。
　　五、流式細胞儀檢測細胞凋亡率
　　利用Annexin V-EGFP凋亡試劑盒(KenGEN,China)處理實驗組和對照組細胞，避光室溫孵育15分鐘后，利用流式細胞儀(BD Biosciences，CA，USA)檢測細胞凋亡率。每個處理進行3次獨

14、立實驗。
　　六、Western blot檢測
　　按照操作說明利用SDS-PAGE電泳以及PVDF轉印技術分離不同分子量的蛋白。常規(guī)電泳、轉膜、封閉，一抗4℃過夜孵育，二抗室溫孵育2h，GAPDH作為內參對照。Western Lightning(⑩)-ECL，Enhanced Chemiluminescence Substrate(PerkinElmer，NEL100001EA)檢測，顯影。UVP圖像處理系統(tǒng)采集圖像，Im

15、ageJ灰度分析軟件進行條帶灰度分析(National institutes of Health, Md, USA)。每個處理進行3次獨立實驗。
　　七、報告基因構建及檢測
　　以cDNA文庫為模板，擴增得到含有miR-125b預測靶位點的p53-3'-UTR序列，連接到pmiR-RB-REPORTTM載體（Ribobio，Guangzhou，China）中構建pmiR-RB-REPORTTM-p53-3'-UTR。利用基因

16、定點突變試劑盒構建含有突變靶位點的熒光報告質粒pmiR-RB-REPORTTM-mut-p53-3'-UTR。按照操作說明利用Lipofectamine2000(Invitrogen，USA)作為轉染試劑，向SRA01/04細胞共轉染pmiR-RB-REPORTTM-p53-3'-UTR/pmiR-RB-REPORTTM-mut-p53-3'-UTR與miR-125b mimic/mimic control。48小時后，利用Dual-L

17、uciferase報告基因檢測系統(tǒng)(Promega，Madison，WI，USA)檢測熒光素酶活性。Renilla熒光素酶質粒作為內參對照，每個處理進行3次獨立實驗。
　　八、統(tǒng)計學分析
　　應用SPSS16.0統(tǒng)計分析軟件進行統(tǒng)計學分析。數(shù)據(jù)以均值±標準差表示，采用獨立t檢驗(independent samples T-test)進行分析。p＜0.05為有統(tǒng)計學意義。
　　實驗結果:
　　一、miR-125b與

18、野生型p53在年齡相關性白內障晶狀體組織中的表達
　　利用RT-qPCR和Western blot方法檢測miR-125b和野生型p53在年齡相關性白內障晶狀體前囊膜的新鮮樣品與正常人晶狀體前囊膜標本中的表達情況。與對照組相比，年齡相關性白內障晶狀體前囊膜組miR-125b的表達顯著降低(p＜0.001)，野生型p53的表達顯著升高(p＜0.001)。結果表明，在組織樣本中miR-125b與野生型p53的表達呈反向趨勢?？紤]到mi

19、croRNA通過與靶基因mRNA互補結合從而抑制靶基因表達的作用方式，p53可能為miR-125b的靶基因。
　　二、miR-125b在人晶狀體上皮細胞凋亡模型中的表達
　　利用RT-qPCR方法檢測miR-125b在人晶狀體上皮細胞凋亡模型與正常人晶狀體上皮細胞系（SRA01/04）中的表達情況。與對照組相比，人晶狀體上皮細胞凋亡模型組miR-125b的表達顯著降低(p＜0.001)。
　　三、轉染效率評定
　

20、　為保證細胞學實驗的效果，我們分別向SRA01/04細胞中轉染miR-125b mimic，mimic control，inhibitor，inhibitor control進行轉染效率的評定。轉染后48小時收集細胞，利用RT-qPCR方法檢測各組miR-125b的含量。轉染miR-125b mimic組miR-125b的表達顯著高于對照組(p＜0.001)，而轉染miR-125b inhibitor組miR-125b的表達顯著低于對照

21、組(p＜0.001)，證明轉染有效可以進行后續(xù)細胞實驗。
　　四、miR-125b對人晶狀體上皮細胞凋亡的影響
　　前述結果中，miR-125b在年齡相關性白內障晶狀體組織和人晶狀體上皮細胞凋亡模型中表達顯著降低，提示miR-125b可能與細胞凋亡密切相關。我們在人晶狀體上皮細胞凋亡模型中調節(jié)miR-125b的表達，利用流式細胞儀檢測細胞凋亡率的改變。轉染miR-125b mimic組細胞凋亡率顯著低于對照組(p＜0.001

22、)，而轉染miR-125b inhibitor組細胞凋亡率顯著高于對照組(p＜0.001)。
　　五、miR-125b靶基因的預測
　　為探討miR-125b潛在的靶基因，使用3種靶基因預測軟件TargetScan5.2，Diana-micro T和miRanda預測靶基因。在眾多預測的靶基因中，被3種預測軟件同時預測到與miR-125b有3個潛在結合位點的野生型P53，在DNA損傷調控細胞增殖和凋亡方面發(fā)揮重要作用，因此我

23、們推測miR-125b可能通過調控野生型p53進而影響細胞凋亡。
　　六、miR-125b調控靶基因p53
　　為證實p53是否為miR-125b的靶基因，我們向人晶狀體上皮細胞凋亡模型轉染miR-125b mimic，mimic control，inhibitor，inhibitor control，轉染后48小時，利用RT-qPCR方法檢測p53 mRNA水平的表達情況，利用Western blot方法檢測p53蛋白水平

24、的表達情況。在轉染miR-125b mimic組，p53的表達在mRNA水平和蛋白水平均顯著降低(p＜0.001)，而轉染miR-125b inhibitor組，p53的表達在mRNA水平和蛋白水平均顯著升高(p＜0.001)。
　　為進一步證實p53是否為miR-125b直接調控的下游靶基因，我們利用Dual-Luciferase報告基因檢測系統(tǒng)驗證miR-125b是否通過p53的3'UTR的靶位點對其表達進行負向調控。向 SR

25、A01/04細胞共轉染pmiR-RB-REPORTTM-p53-3'-UTR和miR-125b mimic，mimic control，共轉染pmiR-RB-REPORTTM-mut-p53-3'-UTR和miR-125b mimic，mimic control。轉染后48小時，檢測熒光素酶活性。結果顯示，與對照組相比，共轉染pmiR-RB-REPORTTM-p53-3'-UTR和miR-125b mimic組熒光素酶活性顯著降低(p＜

26、0.001)，而共轉染pmiR-RB-REPORTM-mut-p53-3'-UTR和miR-125b mimic組熒光素酶活性無統(tǒng)計學差異(p＞0.05)。結果表明，miR-125b通過預測的3'UTR的結合位點與p53直接結合。
　　七、miR-125b通過抑制靶基因p53調控人晶狀體上皮細胞凋亡
　　miR-125b抑制人晶狀體上皮細胞凋亡，抑制p53的表達。為證實miR-125b是否通過抑制p53表達抑制人晶狀體上皮細

27、胞凋亡，我們利用siRNA在SRA01/04細胞中干擾了p53的表達。Western blot驗證干擾效率(p＜0.001)。結果顯示共轉染miR-125b inhibitor與p53 siRNA組miR-125b對細胞凋亡的影響被阻斷，表明miR-125b通過直接抑制靶基因p53的表達對人晶狀體上皮細胞凋亡進行調控。
　　結論:
　　1.miR-125b在年齡相關性白內障晶狀體組織中低表達。
　　2.人晶狀體上皮細胞

28、中miR-125b表達升高時，細胞凋亡減少;而細胞中miR-125b表達降低時，細胞凋亡增加。
　　3.野生型p53是miR-125b的直接靶基因，miR-125b抑制p53的表達，miR-125b與p53的表達呈反向趨勢。
　　4.miR-125b通過直接抑制靶基因p53的表達調控人晶狀體上皮細胞凋亡。5.miR-125b在年齡相關性白內障的發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用，可能成為白內障診斷和治療中一種新的生物學標記或藥物新靶點。