1、年齡相關(guān)性白內(nèi)障是一種中老年疾病，嚴(yán)重危害老年人視力的常見眼科疾病。氧化應(yīng)激是白內(nèi)障發(fā)病的主要因素之一。紫外線輻射、外源性氧化物質(zhì)等均可以使晶狀體上皮細(xì)胞(HLEs)產(chǎn)生活性氧片段(Reactive oxygen species，ROS)，進(jìn)一步使組織和細(xì)胞發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化以及DNA的損害，從而形成白內(nèi)障。自噬是真核細(xì)胞的一種具有自我保護(hù)功能的生理現(xiàn)象，主要幫助細(xì)胞適應(yīng)各種不良刺激，是細(xì)胞維持內(nèi)環(huán)境的自穩(wěn)并且實(shí)現(xiàn)自我更新的基本途徑。上調(diào)自

2、噬可通過(guò)激活磷酸化AKT通路，從而對(duì)HLEs的遷移和增殖具有明顯的促進(jìn)作用，下調(diào)自噬并抑制其功能。查閱相關(guān)文獻(xiàn)，我們發(fā)現(xiàn)調(diào)控自噬水平對(duì)于HLEs的功能影響，特別在H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激中的作用未見相關(guān)報(bào)道。因此，本研究以HLEs-B3細(xì)胞株和人HLEs-B3自噬缺陷細(xì)胞株為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，旨在探索自噬在人晶狀體上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激中的保護(hù)作用及機(jī)理，為年齡相關(guān)性白內(nèi)障的治療提供一種新的治療思路。本研究共分為三個(gè)部分，主要研究方法及結(jié)果如下。

3、>　　第一部分 自噬水平與年齡相關(guān)性白內(nèi)障程度的相關(guān)性。
　　目的:研究自噬水平與年齡相關(guān)性白內(nèi)障程度的相關(guān)性。
　　方法:通過(guò)免疫熒光標(biāo)記檢測(cè)年齡相關(guān)性白內(nèi)障病例的晶狀體前囊膜上皮組織標(biāo)本的自噬水平，分析其與白內(nèi)障程度的相關(guān)性。步驟如下:(1)對(duì)右眼白內(nèi)障手術(shù)病例，根據(jù)裂隙燈評(píng)判晶狀體核性混濁的程度，將NC4級(jí)和NC1級(jí)白內(nèi)障病例納入統(tǒng)計(jì);(2)收集NC4級(jí)和NC1級(jí)的晶狀體上皮組織標(biāo)本并固定;(3)對(duì)晶狀體上皮組織標(biāo)本進(jìn)

4、行LC3的免疫熒光標(biāo)記并檢測(cè);(4)分析LC3熒光強(qiáng)度與白內(nèi)障程度的相關(guān)性。
　　結(jié)果:LC3熒光強(qiáng)度在NC4級(jí)白內(nèi)障中較NC1級(jí)明顯增強(qiáng)。
　　結(jié)論:自噬水平與年齡相關(guān)性白內(nèi)障程度呈一定的相關(guān)性。
　　第二部分 自噬在晶狀體上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激中的作用。
　　目的:比較HLEs-B3自噬缺陷細(xì)胞株和HLEs-B3細(xì)胞株，在外源性H2O2環(huán)境中細(xì)胞活力、氧化及抗氧化能力的差異。
　　方法:通過(guò)HLEs-B3細(xì)胞

5、轉(zhuǎn)染PEP-KO和ATG7-/-質(zhì)粒，構(gòu)建PEP和A7細(xì)胞。然后將細(xì)胞分為六組，B3實(shí)驗(yàn)組和B3對(duì)照組;PEP實(shí)驗(yàn)組和PEP對(duì)照組;A7實(shí)驗(yàn)組和A7對(duì)照組。首先對(duì)比不同濃度的過(guò)氧化氫(H2O2)刺激對(duì)B3細(xì)胞株增殖活力的影響，確定合適的H2O2作用濃度;之后建立外源性H2O2相關(guān)的氧化應(yīng)激模型，對(duì)B3、PEP、A7三種細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞增殖、死亡、氧化及抗氧化能力等指標(biāo)的檢測(cè):(1)通過(guò)CCK-8法檢測(cè)H2O2對(duì)細(xì)胞增殖活力的影響;(2)通過(guò)

6、流式細(xì)胞術(shù)AnnexinⅤ/7-AAD染色檢測(cè)H2O2對(duì)細(xì)胞凋亡的影響;(3)通過(guò)2'7'-二氯熒光乙酰乙酸鈉(DCFH-DA)熒光探針檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)ROS熒光強(qiáng)度的變化;(4)運(yùn)用酶生化法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)GSH、MDA的差異。
　　結(jié)果:(1) CCK-8法顯示300μM H2O2抑制細(xì)胞增殖活力，但A7組較其他組增殖增加;(2) AnnexinⅤ/7-AAD染色顯示，300μM H2O2增加細(xì)胞死亡，但A7組較其他組，細(xì)胞死亡減少;

7、(3)流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示，ROS熒光強(qiáng)度在A7組增加更明顯;(4)酶生化法顯示，H2O2刺激引起A7組GSH值下降更明顯;而MDA值增加更明顯。
　　結(jié)論:在氧化應(yīng)激環(huán)境下，如敲除自噬相關(guān)蛋白7，將降低細(xì)胞抗氧化能力，卻能減少細(xì)胞死亡。
　　第三部分 自噬在晶狀體上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激中的機(jī)制研究。
　　目的:探討自噬調(diào)控H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激的分子機(jī)制。
　　方法:B3細(xì)胞株和HLEs-B3自噬缺陷細(xì)胞株在H2O2處