1、研究目的： 青蒿素（Artemisinin）最初是由我國學(xué)者從菊科植物黃花蒿（Artemisiaannua Linn）葉中提取分離到的具有過氧化基團(tuán)的倍半萜內(nèi)脂類化合物，青蒿琥酯（artesunate）、蒿甲醚（artemether）和二氫青蒿素（dihydroartemisinin）等均為青蒿素的衍生物。這類藥物具有顯著的抗瘧疾、抗血吸蟲、抗弓形蟲等藥理作用。目前青蒿素及其衍生物在臨床上廣泛應(yīng)用于抗瘧治療，是抗瘧特效藥。近年研

2、究發(fā)現(xiàn)青蒿素及其衍生物還具有明確的體內(nèi)外抗腫瘤活性。其藥理研究和臨床驗(yàn)證受到了廣泛關(guān)注。青蒿素及其衍生物以其獨(dú)特的抗腫瘤機(jī)制，可以選擇性地殺傷腫瘤細(xì)胞而對正常細(xì)胞作用很小，目前尚未發(fā)現(xiàn)與傳統(tǒng)化療藥物存在交叉耐藥，而且能通過抑制谷胱甘肽-s-轉(zhuǎn)移酶的活性，逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥，與傳統(tǒng)化療藥物同時應(yīng)用可起到協(xié)同、增效的作用。二氫青蒿素（dihydroartemisinin）是青蒿素類藥物在體內(nèi)的主要活性代謝產(chǎn)物，與其他青蒿素類衍生物相比具

3、有更強(qiáng)的抗腫瘤活性，但其作用機(jī)制尚不夠明確。本研究以乳腺癌細(xì)胞系T47D為研究對象，通過觀察DHA對T47D細(xì)胞增殖，細(xì)胞周期，細(xì)胞凋亡的影響以及對胞內(nèi)凋亡調(diào)控因子基因和蛋白的影響，初步探討其誘導(dǎo)凋亡相關(guān)的分子機(jī)制，為DHA的臨床治療提供實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。 研究方法： 1．采用MTT檢測法細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)觀察二氫青蒿素對乳腺癌細(xì)胞T47D的增殖動力學(xué)的影響，DHA濃度設(shè)5、10、20、40、60、80、100umol/l共

4、7組，分別培養(yǎng)24h，48h和72h，計(jì)算各實(shí)驗(yàn)點(diǎn)的增值抑制率，用SPSS13軟件計(jì)算藥物的50％抑制濃度（IC50值）。抑制率％=（1-藥物組A值/細(xì)胞對照組A值）×100％ 2．流式細(xì)胞術(shù)分析藥物作用前后乳腺癌細(xì)胞T47D細(xì)胞周期的分布情況，根據(jù)MTT結(jié)果篩選合適的藥物濃度和作用時間進(jìn)行分組，DHA濃度設(shè)20、40、60umol/l共3組，培養(yǎng)48h，加入DNA染液（PI50mg/L、RNA酶10ug/mL及1％Triton

5、-X100）500μl避光染色30min后，300目篩網(wǎng)過濾后上機(jī)檢測。同樣實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。用隨機(jī)軟件分析細(xì)胞周期。 3．AnnexinⅤ-PI雙染法檢測藥物作用前后乳腺癌細(xì)胞T47D早期凋亡細(xì)胞比例收集48h藥物濃度20、40、60umol/L組及DMSO對照組的細(xì)胞，加入FITC標(biāo)記的Annexin-Ⅴ（20mg/L）20μl和PI（20mg/L）20μl避光雙染后，流式細(xì)胞術(shù)檢測。同樣實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。 4．逆轉(zhuǎn)錄-聚合

6、酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）法檢測藥物作用前后乳腺癌細(xì)胞T47D胞內(nèi)凋亡調(diào)控因子Bim基因mRNA水平的改變，DHA濃度設(shè)20、40、60umol/l共3組，培養(yǎng)48h，提取總RNA，紫外分光光度計(jì)測定OD260/OD280比值，以估算RNA樣品的濃度及純度。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)結(jié)束后，瓊脂糖凝膠電泳，美國Kodak凝膠成像系統(tǒng)成像，1DImageAnalysisSoftware軟件分析各條帶灰度，以與β-actin的相對比值比較mRNA表達(dá)水平。

7、 5．蛋白質(zhì)印跡技術(shù)（Westernblot）檢測藥物作用前后乳腺癌細(xì)胞T47D胞內(nèi)凋亡調(diào)控因子蛋白tbid，caspase8表達(dá)的變化，DHA濃度設(shè)20、40、60umol/l共3組，培養(yǎng)48h，收集細(xì)胞裂解，裂解液SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)膜，封閉，抗體孵育，于LAS4000mini化學(xué)發(fā)光分析儀中顯影。蛋白表達(dá)水平以各組積分光密度值與actin積分光密度值比值表示。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 1．不同濃度的DHA作用于T4

8、7D細(xì)胞24h、48h、72h后，DMSO溶劑對照組與相應(yīng)時間的細(xì)胞對照組的A值相比無顯著差異（P>0．05），各濃度組與相應(yīng)時間DMSO溶劑對照組A值差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0．01）；經(jīng)相關(guān)性分析，藥物對T47D細(xì)胞的抑制率呈濃度（10，20，40，60，80，100μmol/L）依賴性升高（r=0．911，P<0．01），亦呈時間（24h，48h，72h）依賴性升高（r=0．918，P<0．01），DHA作用24，48，72h的I

9、C50值分別為60．03，33．86，17．18μmol/L。 2．20，40，60μmol/LDHA作用于乳腺癌細(xì)胞48h后，與對照組相比，呈劑量依賴性改變細(xì)胞周期的分布，G0/G1期細(xì)胞比率上升，S期細(xì)胞比率下降，細(xì)胞增殖受阻在G0/G1期。 3．DHA作用48h后20、40、60μmol/L濃度組乳腺癌細(xì)胞T47D的早期凋亡率分別為（20．81±0．68）％，（30．90±0．73）％，（45．32±2．17）％（

10、n=3），各濃度與對照組（0．98±0．08）％相比差異顯著（均為P=0．000）；且隨藥物濃度的增高而升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。（one-wayANOVA；F=53．1，P=0．000） 4．RT-MR檢測BimmRNA水平的改變，結(jié)果顯示，對照組和實(shí)驗(yàn)組均表達(dá)Bim基因，實(shí)驗(yàn)組高于對照組。其中60umol/LDHA組BimmRNA表達(dá)量明顯高于對照組5．WesternBlot檢測凋亡相關(guān)蛋白tbid，caspase8的表達(dá)，2

11、0、40、60μmol/L的DHA作用于乳腺癌細(xì)胞48h后，凋亡相關(guān)蛋白tbid，caspase8的表達(dá)強(qiáng)度與對照組相比差異顯著（均為P<0．05）；且隨DHA濃度的增高而增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論： 1．DHA能顯著抑制人乳腺癌細(xì)胞T47D生長，而且抑制率呈濃度和時間依賴性升高；DHA呈劑量依賴性改變T47D細(xì)胞周期的分布，G0/G1期細(xì)胞比率上升，S期細(xì)胞比率下降，細(xì)胞增殖受阻在G0/G1期，從而抑制腫瘤的生長。