1、目的：本實(shí)驗(yàn)擬通過檢測(cè)線粒體基因組G3460A、G9804A在Leber遺傳性視神經(jīng)病變中位點(diǎn)突變情況，進(jìn)而探討基因組G3460A、G9804A在Leber遺傳性視神經(jīng)病變中致病機(jī)制，以及線粒體母系遺傳在Leber遺傳性視神經(jīng)病變中作用。
　　方法：一個(gè)LHON家系中，先證者有1個(gè)舅舅發(fā)病，其他均正常。調(diào)查該家系所有健在人員共11人，包括先證者、先證者的外婆、母親、父親、2個(gè)舅舅（1個(gè)舅舅未婚單身）、舅媽、舅舅的女兒和兒子、先證者

2、的弟弟和妹妹，并采集10ml抗凝血，采用Ficoll分離液分離外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC），一部分PBMC用來分離線粒體并提取線粒體基因組 DNA，根據(jù)目前報(bào)導(dǎo)的LHON相關(guān) mtDNA突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)PCR引物，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后將PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。另外一部分PBMC用來構(gòu)建線粒體DNA文庫(kù)，然后根據(jù)線粒體基因組設(shè)計(jì)疊瓦狀探針對(duì)DNA文庫(kù)中的線粒體基因進(jìn)行捕獲，將捕獲后的DNA進(jìn)行柱子純化，然后采用Illumina引物進(jìn)行 PCR擴(kuò)

3、增，將 PCR產(chǎn)物純化后，在2代測(cè)序儀Hisiq2500進(jìn)行測(cè)序，并采用生物信息學(xué)分析軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，尋找與LHON相關(guān)的mtDNA突變位點(diǎn)。
　　結(jié)果：采用抽提的線粒體基因組DNA進(jìn)行常見的mtDNA突變位點(diǎn)PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)先證者、發(fā)病的舅舅、外婆以及母親存在G3460A突變位點(diǎn)，并且，先證者的弟弟也存在該突變位點(diǎn)，但沒有發(fā)病。為進(jìn)一步探討該家系 LHON發(fā)病的原因，對(duì)線粒體全基因組進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)先證者、以及發(fā)病的舅舅存

4、在G9804A突變位點(diǎn)，但是，先證者的弟弟在該位點(diǎn)不存在突變。并且，發(fā)現(xiàn)先證者另1個(gè)表型正常的舅舅存在G9804A突變位點(diǎn)。同時(shí)，在這個(gè)家系中還發(fā)現(xiàn)了39個(gè)共同的非熱點(diǎn)突變位點(diǎn)。文獻(xiàn)查閱和生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)G3460A位點(diǎn)突變（氨基酸突變?yōu)锳52T）導(dǎo)致電子呼吸鏈酶復(fù)合體I中的亞單位（NADH脫氫酶）的活性降低，復(fù)合物I在光誘導(dǎo)的神經(jīng)傳導(dǎo)通路中具有非常重要作用；G9804A位點(diǎn)突變（氨基酸突變?yōu)锳200T）會(huì)導(dǎo)致電子呼吸鏈酶復(fù)合體IV中