1、碘對甲狀腺功能的影響表現(xiàn)為循環(huán)碘及甲狀腺內(nèi)部有機(jī)碘儲備狀況改變了甲狀腺自身的碘代謝行為及其對垂體TSH的敏感性。這種作用不依賴于垂體TSH，其目的是維持合適碘池、穩(wěn)定甲狀腺功能，屬于甲狀腺功能的自我調(diào)控作用。甲狀腺激素的合成與分泌是一個連續(xù)而復(fù)雜的生理過程，主要涉及鈉共轉(zhuǎn)運體(NIS)、甲狀腺髓過氧化物酶(TPO)、甲狀腺球蛋白(TG)、及促甲狀腺素受體(TSHr)等甲狀腺特異蛋白及這些蛋白表達(dá)的主要轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子TTF-1、TTF-2、

2、PAX8的表達(dá)及活性。甲狀腺內(nèi)外碘的變化，通過各種復(fù)雜的機(jī)制，最終導(dǎo)致甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子及甲狀腺特異蛋白的變化，實現(xiàn)甲狀腺功能的自我調(diào)控。
　　 甲狀腺功能調(diào)控的研究，需選擇合適的實驗?zāi)Ｐ?。動物水平的研究由于影響因素眾多，不易闡明某種因素的具體作用及機(jī)制；體外條件下，多數(shù)甲狀腺細(xì)胞，呈單層細(xì)胞生長，無法形成濾泡結(jié)構(gòu)，缺乏完整的激素合成、儲備及分泌功能，均不是甲狀腺功能調(diào)控研究的最佳選擇。體外重構(gòu)甲狀腺濾泡，克服了上述二種模型的不足，

3、既脫離了體內(nèi)復(fù)雜的調(diào)控環(huán)境，又兼?zhèn)渫暾墓δ?，是甲狀腺功能調(diào)控研究理想實驗?zāi)Ｐ汀?br>　　 本文對體外重構(gòu)豬甲狀腺濾泡的誘導(dǎo)方法進(jìn)行了探討，從甲狀腺濾泡的形態(tài)、功能及甲狀腺特異蛋白表達(dá)三方面證實體外重構(gòu)豬甲狀腺濾泡模型構(gòu)建成功。在此基礎(chǔ)上，利用Wenstern-blolt、RealTimeRT-PCR、ELISA、RIA等方法及免疫熒光、激光共聚焦顯微鏡觀察、創(chuàng)新的甲狀腺濾泡腔TG提取等技術(shù)，對高碘(HI)及低碘(LI)下甲狀腺特異

4、蛋白，甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子、甲狀腺激素分泌、濾泡腔TG的碘化度進(jìn)行深入研究，探討碘對甲狀腺功能的調(diào)控作用及分子機(jī)制。主要研究內(nèi)容及結(jié)果如下：
　　 ㈠豬體外重構(gòu)甲狀腺濾泡的構(gòu)建及鑒定。
　　 ⑴豬體外重構(gòu)甲狀腺濾泡的構(gòu)建方法：依照下列要點：①豬甲狀腺低胰蛋白酶(0.1％)消化。②震蕩法分散細(xì)胞。③1.5-3X106/L高密度、均勻接種。④接種頭3天時在培養(yǎng)基中加入1 mIU/mlTSH及15％的胎牛血清。⑤濾泡形成后改胎牛血清

5、為10％小牛血清。經(jīng)過3天的培養(yǎng)，即可形成了大量球狀或半球狀的重構(gòu)甲狀腺濾泡。
　　 ⑵體外重構(gòu)甲狀腺濾泡的形態(tài)學(xué)鑒定：用普通倒置顯微鏡可以觀察到形成的圓圈樣結(jié)構(gòu)及細(xì)胞團(tuán)，直徑約10-100um；相差倒置顯微鏡下，圓圈樣結(jié)構(gòu)為半球狀濾泡的貼壁面，穹窿頂由細(xì)胞構(gòu)成；免疫熒光染色，利用激光共聚焦顯微鏡的“光學(xué)切片”作用下可以清晰地觀察到細(xì)胞團(tuán)是由周邊的甲狀腺細(xì)胞及內(nèi)部的濾泡腔構(gòu)成。
　　 ⑶體外重構(gòu)甲狀腺濾泡的功能學(xué)鑒定：①

6、重構(gòu)濾泡組上清液中有FT3、FT4的分泌，濾泡腔有TG的儲備，而單層細(xì)胞組幾乎未能檢測到FT3、FT4分泌及TG儲備。②重構(gòu)濾泡組：高碘干預(yù)甲狀腺特異蛋白NIS、TG、TPO、TSHr及甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子TTF-1、PAX8mRNA的表達(dá)高于低碘干預(yù)組。單層細(xì)胞組：高碘干預(yù)組上述指標(biāo)表達(dá)均低于低碘干預(yù)組。
　　 ㈡以體外重構(gòu)豬甲狀腺濾泡為實驗?zāi)Ｐ?，研究碘對甲狀腺功能的調(diào)控作用。
　　 ⑴高碘干預(yù)組甲狀腺激素合成相關(guān)基因NIS

7、、TPO、TGmRNA表達(dá)顯著高于低碘組。
　　 ⑵高碘干預(yù)組培養(yǎng)上清液中FT3、FT4分泌顯著多于低碘組。
　　 ㈢碘對甲狀腺功能調(diào)控作用的分子機(jī)制研究：
　　 ⑴高碘干預(yù)組TSHr、TTF-1、PAX8mRNA表達(dá)及蛋白合成顯著高于低碘組。
　　 ⑵高碘干預(yù)組甲狀腺濾泡腔TG碘化度高于低碘組；高碘+MMI(甲硫咪唑)組較單純高碘組濾泡腔TG的碘化度顯著下降；高碘組TSHr、TTF-1、PAX8mRNA

8、表達(dá)及蛋白合成較低碘組及高碘+MMI顯著上調(diào)；高碘+MMI組較MMI+高碘組TSHr、TTF-1、PAX8mRNA表達(dá)有升高的趨勢。
　　 ⑶PKA阻斷組：TTF-1、TSHrmRNA表達(dá)及蛋白合成較對照組顯著上調(diào)；IP3阻斷組：TTF-1、TSHrmRNA表達(dá)及蛋白合成較對照組顯著上調(diào)；PKA阻斷組及IP3阻斷組：NIS的表達(dá)較對照組上調(diào)；PKA阻斷組：NIS2的表達(dá)較對照組上調(diào) IP3阻斷組：NIS2的表達(dá)較對照組下調(diào)。

9、r>　　 結(jié)論：
　　 ⑴保持細(xì)胞膜的完整性、高密度均勻接種、增加細(xì)胞的接觸、粘附、聚集的機(jī)會和能力，是體外重構(gòu)甲狀腺濾泡形成的關(guān)鍵；避免使用胎牛血清是防止甲狀腺濾泡結(jié)構(gòu)蛻變?yōu)閱螌咏Y(jié)構(gòu)，維持甲狀腺濾泡形態(tài)的重要因素。
　　 ⑵體外重構(gòu)甲狀腺濾泡脫離了體內(nèi)復(fù)雜環(huán)境，又具備完整的甲狀腺功能，是甲狀腺功能調(diào)控作用及機(jī)制研究的理想實驗?zāi)Ｐ?，可用于觀察甲狀腺濾泡形成過程，探討甲狀腺濾泡結(jié)構(gòu)、濾泡內(nèi)容物對甲狀腺功能的調(diào)控作用。

10、r>　　 ⑶高碘組甲狀腺激素合成相關(guān)基因NIS、TG、TPO高表達(dá)，培養(yǎng)上清液FT3、FT4高分泌，甲狀腺激素的合成及分泌功能處于活躍狀態(tài)，在濾泡層面上，碘對甲狀腺激素合成及分泌功能具有促進(jìn)作用。
　　 ⑷碘離子、MMI影響濾泡腔TG的碘化，其本身對TSHr及TTF-1的表達(dá)無直接作用；TSH/TSHr信號的CAMP/AKP及磷脂酶C/IP3途徑對TTF-1、TSHr的表達(dá)亦無上調(diào)作用，TTF-1、TSHr高表達(dá)是濾泡腔TG高

11、碘化的直接結(jié)果。
　　 ⑸碘離子提高了濾泡腔TG的碘化度，通過調(diào)控TTF-1，進(jìn)而上調(diào)TSHr的表達(dá)，增強(qiáng)了甲狀腺濾泡對中樞TSH/TSHr信號的敏感性，是其功能自我調(diào)控的重要途徑之一。
　　 ⑹TG高碘化時，TSHr表達(dá)上調(diào)，濾泡對中樞信號敏感，促進(jìn)了NIS、TPO、TG的表達(dá)及激素的分泌。是其功能活躍的原因之一。
　　 ⑺TSH/TSHr信號的不同傳導(dǎo)途徑對NIS及NIS2具有不同的調(diào)控作用，提示在NISmR

12、NA剪接水平上中樞信號參與NIS不同亞型表達(dá)的調(diào)控。
　　 綜上，我們發(fā)現(xiàn)：在重構(gòu)濾泡這一層面上，碘影響濾泡腔TG的碘化度，通過調(diào)控TTF-1，進(jìn)而上調(diào)TSHr的表達(dá)，改變了濾泡對中樞TSH/TSHr信號的敏感性。TG的碘化程度不同，濾泡對中樞TSH/TSHr信號敏感性存在差異，是甲狀腺適應(yīng)內(nèi)外碘環(huán)境的變化，實現(xiàn)功能自我調(diào)控的重要途徑之一；TG高碘化時，TSHr表達(dá)上調(diào)，濾泡對中樞信號敏感，促進(jìn)了NIS、TPO、TG的表達(dá)及甲狀