1、為了研究GADD45基因在轉(zhuǎn)錄水平表達變化和受照劑量之間的關(guān)系,該實驗選取健康人外周血單個核細(xì)胞為實驗對象,應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄半定量PCR的實驗方法,測定該基因mRNA的相對量.首先根據(jù)文獻選擇特異性引物,在genbank上進行核實,擴增GADD45基因片段.選擇在人體內(nèi)穩(wěn)定表達的β-actin為內(nèi)參,合成引物序列并與GADD45進行同管擴增,產(chǎn)物電泳后在凝膠成像儀上用PCR分析軟件分析條帶的灰度及密度等因素,兩者比值(GADD45/β-act

2、in)表示GADD45基因的相對量.將100ml健康獻血員外周血平均置于6個40ml培養(yǎng)瓶中,分別給予0、1、2、3、4、5Gy X射線照射,提取單個核細(xì)胞,加入含10﹪胎牛血清的1640液后置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng),在培養(yǎng)0h、4h、8h、16h、20h和24h的6個時間點測定GADD45基因的含量.實驗采用6×6析因設(shè)計,每交叉點重復(fù)測量4次,實驗結(jié)果(基因mRNA相對量)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,用SARS軟件分析數(shù)據(jù),比較照射后不同時

3、間點之間、不同照射劑量之間、以及不同照射劑量的各個時間點之間是否有統(tǒng)計學(xué)差異;作照射后各時間點GADD45表達量與照射劑量的直線相關(guān)分析;作不同照射劑量下GADD45表達量與照射后時間的非線性曲線擬合.實驗結(jié)果顯示,照射后各個時間點上GADD45基因表達量間有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05).觀察照射劑量與基因表達量的關(guān)系可看出,在所觀察的各時間點上,基因表達量隨照射劑量增加而增加,存在直線關(guān)系,得出直線回歸方程.觀察每個劑量組的基因表達量和

4、時程之間的關(guān)系,得出1-5Gy的5個劑量趨勢一致:照射后基因表達增加,在照后4小時GADD45基因相對量達最高峰,此后下降,在觀察到的最長時間點上(24h)該基因量仍未降至初始水平.該次實驗結(jié)果表明,X線照射可誘導(dǎo)GADD45基因表達照射隨劑量增加而增加,具有較好的線性關(guān)系.這與國內(nèi)外關(guān)于X線照射誘導(dǎo)G1期阻滯及相應(yīng)基因表達變化的實驗結(jié)果一致,也再次證明了作為P53下游基因的GADD45基因在輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞G1期阻滯中所起的重要作用.因