1、鉛是一種常見的職業(yè)與環(huán)境污染物，具有顯著神經毒性作用，可造成學習記憶的損傷。迄今，鉛損害學習記憶方面的研究雖然取得了一些進展，但具體機制仍不十分清楚，還有待進一步的研究。
　　腦的高級神經活動是由相互作用的神經元-膠質細胞網絡共同參與調控的。星形膠質細胞(Astrocyte，AS)是腦組織內數(shù)量最多和分布最廣的神經膠質細胞，其對神經元的發(fā)育和遷移、突觸的形成、遞質傳遞的調節(jié)以及內、外環(huán)境的穩(wěn)定等都起著十分重要的作用。腦組織超微結構

2、顯示，AS與毛細血管內皮細胞、基膜和周細胞等共同構成血-腦屏障，血液中的外來化學物質必須通過AS才能進入神經元。另外，研究發(fā)現(xiàn)AS是鉛的“儲藏池”。因此，我們有理由推測AS可能是鉛在腦組織中初始損傷的靶細胞。
　　研究顯示，AS能夠通過分泌膠質源性神經調質影響突觸前膜神經遞質的釋放和突觸后膜的受體反應，進而調節(jié)突觸可塑性。如果AS是鉛損傷的初始靶細胞，那么其功能異常能否引起突觸形成及神經元信號轉導的異常呢？
　　綜上所述，本

3、實驗以神經元-膠質細胞網絡為研究主線，以原代培養(yǎng)的AS和神經元為試驗對象，探討AS內鉛能否對突觸形成與神經元內信息傳遞產生影響，為揭示鉛損害學習記憶功能的機制提供新的研究方向和實驗數(shù)據。
　　方法：
　　1、AS原代培養(yǎng)及ACM的制備
　　取出生1～3天Wistar大鼠仔鼠，消毒后，斷頭取大腦皮質，剪碎、胰酶消化結合機械吹打使細胞分散，將細胞懸液接種在玻璃培養(yǎng)皿中，差速粘附處理去除成纖維細胞，將未粘附的細胞懸液接種在培

4、養(yǎng)瓶中。GFAP染色鑒定細胞純度。
　　純化AS形成單層，換成含鉛濃度為0、50、100和200μmol/L的培養(yǎng)液，培養(yǎng)72 h。鉛暴露后，棄培養(yǎng)液，換成含0和25μmol/L谷氨酸的細胞外液，作用10 min，棄去培養(yǎng)基，換成無血清培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)6h，收集細胞培養(yǎng)液，離心過濾，制成AS條件培養(yǎng)液，保存?zhèn)溆谩?br>　　2、神經元的培養(yǎng)與純化
　　取新生Wistar大鼠仔鼠，分離大腦皮質，剪碎后胰酶消化，過濾，離心，加入

5、含20％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液制成細胞懸液，接種培養(yǎng)24 h。換Neurobasalmedium并加入阿糖胞苷，培養(yǎng)3d后半量換液，繼續(xù)培養(yǎng)3d，特異性烯醇化酶染色鑒定細胞純度。
　　3、神經元分組與處理
　　將原代培養(yǎng)的神經元隨機分為純培養(yǎng)組（原代培養(yǎng)神經元不加入ACM）、非Glu誘導的ACM處理組、Glu誘導（無鉛暴露）ACM處理組和50、100和200μmol/L鉛暴露的ACM處理組。加入ACM時棄去神經元純培養(yǎng)體系

6、中5/7的培養(yǎng)液，新加培養(yǎng)液由ACM和Neurobasal medium按3∶2構成。
　　4、檢測指標與方法
　　(1) GFAP和NSE免疫熒光染色鑒定AS和神經元
　　(2)倒置顯微鏡觀察鉛暴露AS細胞形態(tài)及生長狀態(tài)并采集圖像
　　(3) AlamarBlue法檢測細胞活力
　　(4)倒置顯微鏡觀察不同ACM處理的神經元細胞形態(tài)并采集圖像
　　(5) Western Blotting法檢測神經元

7、SYP蛋白表達
　　(6)突觸素免疫熒光雙標細胞化學染色觀察紅色熒光顆粒數(shù)
　　(7) Western Blot法檢測NR1、NR2A、NR2B、CaMKⅡ和AC蛋白的表達
　　5、統(tǒng)計分析
　　實驗數(shù)據采用SPSS17.0進行統(tǒng)計分析。多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，組間兩兩比較采用q檢驗(SNK)。以P＜0.05作為差異有統(tǒng)計學意義的判定標準。
　　結果：
　　1、AS與神經元免疫熒光

8、鑒定
　　GFAP免疫熒光反應陽性細胞為AS，其胞漿呈紅色;NSE免疫熒光反應陽性細胞為神經元，胞漿被染成綠色，經計數(shù)神經元純度大于95％，可以進行下一步實驗研究。
　　2、鉛暴露后AS形態(tài)觀察
　　50和100μmol/L鉛暴露組AS形態(tài)與對照組相比未見明顯改變，而200μmol/L鉛暴露組的少量細胞開始脫壁，細胞間隙增大;隨鉛暴露濃度的增加，脫壁細胞數(shù)量明顯增多，400μmol/L鉛暴露組細胞變大，突起變短或消失。

9、800μmol/L鉛暴露組細胞大量脫壁，細胞數(shù)量明顯減少。
　　3、不同劑量鉛暴露對AS活力的影響
　　各鉛暴露組細胞活力隨染鉛濃度的升高而下降，200μmol/L鉛暴露組細胞活力為對照組的77％，800μmol/L鉛暴露組細胞活力僅為對照組的一半。
　　4、不同ACM處理后神經元形態(tài)觀察
　　培養(yǎng)5d后的神經元細胞5-10個聚集成團，周圍突起清晰，均勻細長，突起之間相互交織成網。與純培養(yǎng)組比較，無鉛暴露ACM處

10、理組的神經元集落間突起豐富，網絡稠密;與無鉛暴露ACM處理組比較，200μmol/L鉛暴露ACM處理組的神經元突起連接相對稀疏，連接收到損傷。
　　5、鉛暴露AS的對神經元內SYP蛋白表達的影響
　　與純培養(yǎng)組相比，各時段的非Glu誘導的ACM處理組和Glu誘導的ACM處理組的神經元內SYP蛋白含量顯著增加;與無鉛暴露ACM處理組相比，培養(yǎng)72h的各鉛暴露的ACM處理組的神經元內SYP蛋白含量隨染鉛劑量的升高而顯著降低，培養(yǎng)

11、48 h的200μmol/L鉛暴露ACM處理組的神經元內SYP蛋白含量顯著降低，培養(yǎng)24 h的各鉛暴露的ACM處理組的神經元內SYP蛋白含量未見顯著改變。
　　6、突觸素熒光染色觀察突觸形成
　　突觸素熒光標記物呈紅色顆粒狀，沿神經元胞體和突起排列，可清晰勾勒出神經元胞體和突起的輪廓，有的呈串珠狀，在胞體部分有些可融合成塊狀。非Glu誘導的ACM處理組和Glu誘導的ACM處理組的SYP熒光顆粒數(shù)顯著高于純培養(yǎng)組。此外，非誘導

12、的ACM處理組的SYP熒光顆粒數(shù)也顯著高于Glu誘導的ACM處理組。各鉛暴露的ACM處理組的SYP熒光顆粒數(shù)量與無鉛暴露的ACM處理組比較顯著降低，并隨鉛暴露劑量的升高而降低，差異有統(tǒng)計學意義。
　　7、鉛暴露ACM對神經元NMDA受體亞單位、CaMKⅡ、AC蛋白表達的影響
　　與純培養(yǎng)組相比，培養(yǎng)8h的非Glu誘導的ACM處理組的神經元內NR1蛋白表達顯著增加，而Glu誘導的ACM處理組的神經元內NR1蛋白表達顯著減少;與

13、非Glu誘導的ACM處理組相比，培養(yǎng)4h和8h的Glu誘導的ACM處理組的神經元內NR1蛋白表達顯著減少;與無鉛暴露的ACM處理組相比，培養(yǎng)4h的200μmol/L鉛暴露的ACM處理組、培養(yǎng)8h的100和200μmol/L鉛暴露的ACM處理組及培養(yǎng)12h的各濃度鉛暴露的ACM處理組的神經元內NR1蛋白含量顯著減少。與純培養(yǎng)組相比，非Glu誘導的ACM處理組及培養(yǎng)4h、12 hGlu誘導的ACM處理組NR2A蛋白表達顯著增加，培養(yǎng)8 hG

14、lu誘導的ACM處理組NR2A蛋白表達顯著減少;與非Glu誘導的ACM處理組相比，各時段誘導無鉛暴露ACM處理組NR2A蛋白表達顯著減少;與無鉛暴露ACM處理組相比，培養(yǎng)4h各劑量鉛暴露ACM處理組神經元內NR2A蛋白表達沒有差異;培養(yǎng)8h的200μmol/L鉛暴露ACM處理組及12 h各鉛暴露ACM處理培養(yǎng)組神經元內NR2A蛋白表達明顯減少。與純培養(yǎng)組相比，各時段非Glu誘導的ACM組和Glu誘導ACM處理組神經元內NR2B蛋白表達顯

15、著增高;與非Glu誘導的ACM處理組相比，Glu誘導ACM處理組NR2B蛋白表達4h顯著增高，8h及12h顯著減少;與無鉛暴露ACM處理組相比，4h各劑量鉛暴露ACM處理組神經元內NR2B蛋白顯著增加;8h、12h鉛暴露ACM處理組神經元內NR2B蛋白表達均為50、100μmol/L組顯著增加，200μmol/L組顯著減少。
　　與純培養(yǎng)組相比，各時段非Glu誘導的組和Glu誘導的ACM處理組神經元內CaMKⅡ蛋白表達顯著增高;與

16、非Glu誘導的ACM處理組相比，培養(yǎng)12 hGlu誘導的ACM處理組神經元內CaMKⅡ蛋白表達顯著減少;與無鉛暴露ACM處理組相比，培養(yǎng)4h的各劑量鉛暴露ACM處理組神經元內CaMKⅡ蛋白表達沒有差異;培養(yǎng)8h的200μmol/L鉛暴露ACM處理組及12 h各劑量鉛暴露ACM處理組神經元內CaMKⅡ蛋白表達顯著減少。與純培養(yǎng)組相比，各時段非Glu誘導的ACM處理組和Glu誘導ACM處理組神經元內AC蛋白表達顯著增高;與非Glu誘導的AC

17、M處理組相比，Glu誘導ACM處理組神經元內AC蛋白表達培養(yǎng)4h及12h顯著增加;與無鉛暴露ACM處理組相比，培養(yǎng)4h的100、200μmol/L鉛暴露ACM處理組及培養(yǎng)8h、12h各劑量鉛暴露ACM處理組神經元內AC蛋白表達明顯減少。
　　結論：
　　1、鉛暴露AS可間接抑制神經元間突觸的形成。
　　2、鉛暴露AS對突觸形成的抑制作用可能與其抑制神經元內NMDAR的亞單位表達，進而干擾CaMKⅡ和AC依賴的信號轉導通