1、在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，突觸周圍一般都有星形膠質(zhì)細(xì)胞的突起包繞，因此星形膠質(zhì)細(xì)胞被看成是繼突觸前、后成份之后構(gòu)成突觸的第三成份。這些包繞突觸的膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)突觸到底如何起作用至今知之甚少。近十幾年的研究表明，膠質(zhì)細(xì)胞除起支持、分隔和營(yíng)養(yǎng)作用外，還有調(diào)節(jié)神經(jīng)元間的信號(hào)傳遞、神經(jīng)分泌等作用，但對(duì)突觸形成及突觸可塑性作用的報(bào)告不多。膠質(zhì)細(xì)胞能直接影響突觸形成的證據(jù)主要源于Pfrieger和Barres等的工作，他們發(fā)現(xiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液能顯著增加大鼠視

2、網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(RGCs)形成突觸的數(shù)量。迄今為止，在培養(yǎng)的海馬、下丘腦、脊髓及干細(xì)胞來(lái)源的神經(jīng)元上也得到同樣的結(jié)果，而且發(fā)現(xiàn)外周神經(jīng)系統(tǒng)施萬(wàn)細(xì)胞也參與神經(jīng)肌肉連接處突觸的形成和維持。但星形膠質(zhì)細(xì)胞是通過(guò)何種機(jī)制影響突觸形成和可塑性的至今尚不清楚。 以往的研究已顯示，腦內(nèi)固醇類物質(zhì)如雌激素參與了神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育、性分化、生理和病理等，同時(shí)也被證明參與了部分突觸功能的調(diào)節(jié)，故被稱為“神經(jīng)活性固醇(neuroactivesteroid

3、s)”。本室曾研究證明膠質(zhì)細(xì)胞瘤和神經(jīng)干細(xì)胞中有高活性的芳香化酶表達(dá)，芳香化酶是神經(jīng)類固醇物質(zhì)代謝過(guò)程中關(guān)鍵的酶，能催化雄激素轉(zhuǎn)化為雌激素，這提示星形膠質(zhì)細(xì)胞可能合成雌激素。另外我們發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元中有豐富的ER-alpha和ER-beta兩種雌激素受體(ER)表達(dá)。因此推測(cè)膠質(zhì)細(xì)胞合成并分泌的雌激素可能通過(guò)雌激素受體作用于神經(jīng)元，激活下游信號(hào)，參與了突觸的形成與信息傳遞的調(diào)節(jié)過(guò)程。為驗(yàn)證我們的假設(shè)，本實(shí)驗(yàn)以純培養(yǎng)新生大鼠皮層神經(jīng)元為模型，用

4、細(xì)胞培養(yǎng)、ELISA、免疫熒光技術(shù)、突觸記數(shù)、膜片鉗技術(shù)和FM4-64活體染色標(biāo)記的突觸囊泡釋放實(shí)驗(yàn)等方法探討星形膠質(zhì)細(xì)胞(AST)是否參與突觸的形成和信息傳遞，及其可能的作用分子。我們實(shí)驗(yàn)獲得的主要結(jié)果匯報(bào)如下： 1.純培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞能合成并分泌雌激素，而純培養(yǎng)神經(jīng)元的上清液中則檢測(cè)不到雌激素 在第一部分的實(shí)驗(yàn)中，我們首先對(duì)文獻(xiàn)報(bào)道的原代皮層膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元純化和培養(yǎng)方案進(jìn)行了優(yōu)化，進(jìn)行了新生大鼠皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞(

5、astrocytes，AST)和神經(jīng)元的純培養(yǎng)，同時(shí)用免疫細(xì)胞化學(xué)法對(duì)培養(yǎng)的AST和神經(jīng)元進(jìn)行了膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glialfibrillaryacidicprotein，GFAP)和神經(jīng)元微管相關(guān)蛋白(microtubule-associatedprotein2，MAP2)及神經(jīng)絲蛋白200(neurofilament200，NF200)的免疫組化染色，并行細(xì)胞計(jì)數(shù)，結(jié)果顯示培養(yǎng)純化后的AST和神經(jīng)元的純度均可達(dá)99％以上。通過(guò)ELI

6、SA方法檢測(cè)星形膠質(zhì)細(xì)胞傳代培養(yǎng)至第2h、7d、14d和21d時(shí)的星型膠質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)液(astrocyte-conditionedmedium，ACM)中雌激素E2的濃度，分別為(ng/L)：0、117±21、266±22、252±27。對(duì)照組各時(shí)相點(diǎn)均未檢出E2。雌激素濃度在培養(yǎng)初期隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，第14d時(shí)達(dá)到高峰，此后分泌能力有所降低，21d時(shí)仍保持較高的濃度。而純培養(yǎng)的大腦皮層神經(jīng)元在2d，4d，8d和13d時(shí)的培養(yǎng)上清

7、中則未測(cè)得E2的存在。上述結(jié)果表明，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中當(dāng)ACM加入純培養(yǎng)的神經(jīng)元時(shí)，內(nèi)源性的E2主要來(lái)源于AST，而非神經(jīng)元自身產(chǎn)生。 2.外源性雌激素能夠基本模擬ACM(或AST)促突觸形成和增強(qiáng)突觸傳遞的作用在這部分實(shí)驗(yàn)中，我們以純培養(yǎng)之神經(jīng)元(GroupP)、與AST混合培養(yǎng)的神經(jīng)元(GroupM)、加有ACM純培養(yǎng)的神經(jīng)元(GroupA)及加有外源性E2的純培養(yǎng)神經(jīng)元(GroupE)為研究對(duì)象(即實(shí)驗(yàn)分4組)，應(yīng)用突觸計(jì)數(shù)和膜片

8、鉗技術(shù)觀察了各組突觸形成的數(shù)量和微小突觸后電流(minipostsynapticcurrents，mPSCs)的幅度及頻率。其中GroupP，A，M和E的突觸數(shù)量(個(gè)/細(xì)胞)分別為：14±3，79±9，83±11，80±9；各組mPSCs的幅度與頻率依次為20.5±2pA，13±4/min；29.1±3pA，73±16/min；31.3±3pA，78±20/min；30.2±3pA，76±18/min。上述結(jié)果顯示加有ACM純培養(yǎng)的神經(jīng)

9、元與AST混合培養(yǎng)的神經(jīng)元具有同樣的促突觸形成和增強(qiáng)mPSCs的幅度及頻率的作用，兩者明顯高于純培養(yǎng)神經(jīng)元形成的突觸數(shù)量和mPSCs的幅度及頻率，這表明AST促進(jìn)突觸形成和傳遞的作用主要是通過(guò)旁分泌而不是直接接觸起作用的，分泌的因子溶解在ACM中通過(guò)擴(kuò)散作用到達(dá)神經(jīng)元引起效應(yīng)。當(dāng)外源性E2加入純培養(yǎng)的神經(jīng)元中時(shí)，發(fā)現(xiàn)也具有促進(jìn)突觸形成和傳遞的作用，且基本能夠模擬ACM和AST的效應(yīng)。結(jié)合第一部分的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們可以這樣推理：AST促突觸

10、形成和增強(qiáng)mPSCs的作用主要通過(guò)分泌至ACM中的因子介導(dǎo)，而這個(gè)可溶性因子很有可能是AST自身分泌的雌激素E2。為進(jìn)一步驗(yàn)證這一假設(shè)，同時(shí)也為探討膠質(zhì)源性的E2促突觸發(fā)生及傳遞作用的可能機(jī)制，我們進(jìn)行了下面的實(shí)驗(yàn)。 3.膠質(zhì)源性的雌激素可能通過(guò)雌激素受體(estrogenreceptor，ER)介導(dǎo)其促突觸形成及增強(qiáng)突觸傳遞的作用 實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)純培養(yǎng)的神經(jīng)元中能夠表達(dá)ER，且免疫熒光顯示主要存在細(xì)胞核中。眾所周知，雌

11、激素引起生物學(xué)效應(yīng)的主要信號(hào)通路是通過(guò)其受體ER轉(zhuǎn)導(dǎo)的基因機(jī)制生效(但現(xiàn)在也發(fā)現(xiàn)部分雌激素的生物學(xué)效應(yīng)還通過(guò)非基因機(jī)制起作用)，如果膠質(zhì)源性的E2確實(shí)是ACM促突觸發(fā)生及傳遞作用的主要分子，則應(yīng)用ER阻斷劑則可以阻斷ACM的作用。因此我們?cè)贏CM加入純培養(yǎng)神經(jīng)元的同時(shí)加入ER阻斷劑Tamoxifen(GroupA+T)，同時(shí)設(shè)立對(duì)照組即只加有Tamoxifen的純培養(yǎng)神經(jīng)元(GroupT)和純培養(yǎng)神經(jīng)元(GroupP)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Tamo

12、xifen加入后，加有ACM的純神經(jīng)元中突觸形成的數(shù)量由79±9個(gè)顯著下降為32±3個(gè)；mPSCs的幅度與頻率均下降，分別為24.5±2pA，35±10/min。對(duì)照組GroupT的相應(yīng)數(shù)據(jù)為29±3個(gè)；22.13±2pA，37±10/min，但均大于純培養(yǎng)神經(jīng)元(GroupP)的相應(yīng)參數(shù)?？梢钥闯瞿z質(zhì)源性的E2基本是ACM促突觸發(fā)生及傳遞作用的主要分子，并且主要通過(guò)ER起作用，但有趣的是Tamoxifen并不能完全阻斷ACM的作用。最

13、后，為進(jìn)一步弄清膠質(zhì)源性的E2是否通過(guò)突觸前機(jī)制調(diào)節(jié)突觸的傳遞功能，我們進(jìn)行了FM4-64活體標(biāo)記的囊泡釋放實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明GroupA，M和E三組囊泡釋放動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)基本相似，釋放的速度和徹底度明顯強(qiáng)于GroupP，同樣Tamoxifen能明顯抑制ACM的促囊泡釋放作用。 綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)AST在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中除具有傳統(tǒng)的作用外，還具有促進(jìn)突觸形成和傳遞的作用，這一作用主要通過(guò)AST自身合成并分泌到ACM中的E2實(shí)現(xiàn)，并通過(guò)E