1、供體細胞重編程不完全是體細胞克隆效率低的主要原因，包括DNA甲基化、印記基因表達、X染色體失活、組蛋白修飾等方面。為此，本研究擬探討雌雄體細胞克隆(SCNT)胚胎的發(fā)育、DNA甲基化及其甲基化轉(zhuǎn)移酶、組蛋白H3K9甲基化的差異，以及印記基因Xist、H19、IGF2的甲基化和表達水平，并通過降低H3K9me3和Xist的表達，以期提高克隆效率。研究結(jié)果如下:
　　1.水牛成纖維細胞性別對SCNT胚胎發(fā)育的影響
　　比較雌雄S

2、CNT胚胎發(fā)育潛能和速度的結(jié)果顯示，SCNT-♀胚胎的囊胚率顯著高于SCNT-♂胚胎（P＜0.05），與來自于X、Y精子的單精子胞質(zhì)內(nèi)注射胚胎(ICSI-X和ICSI-Y)及體外受精(IVF)胚胎相比差異不顯著(P＞0.05)。此外，SCNT-♀和SCNT-♂胚胎的發(fā)育速度快于IVF胚胎，SCNT-♀、SCNT-♂的8細胞率(48h)和囊胚率(120h)顯著高于IVF組(P＜0.05)。QRT-PCR檢測OCT4、SOX2、NANOG在

3、各類胚胎的表達結(jié)果顯示:SCNT-♀桑椹胚的OCT4和NANOG以及囊胚期NANOG表達量顯著高于SCNT-♂組（P＜0.05），而SCNT-♂囊胚期OCT4的表達量顯著高于SCNT-♀組(P＜0.05)，SOX2在SCNT-♀和SCNT-♂的桑椹胚和囊胚的表達差異不顯著(P＞0.05)。
　　2.雌雄水?？寺∨咛ゼ谆町惖难芯?br>　　比較雌雄SCNT胚胎DNA甲基化及其甲基化轉(zhuǎn)移酶和H3K9me2、H3K9me3的表達水平

4、，探討SCNT胚胎甲基化差異的分子機制。采用免疫組化檢測5mC、5hmC以及H3K9me2、H3K9me3的表達;QRT-PCR分析Dnmts和TETs mRNA的表達水平。結(jié)果顯示:5mC、5hmC分別主要表達于SCNT-♀、SCNT-♂胚胎，且SCNT-♀胚胎甲基化水平低于SCNT-♂胚胎;而Dnmt1、Dnmt3a和Dnmt3b在SCNT-♀和ICSI-X早期胚胎的表達差異不顯著(P＞0.05)，但在SCNT-♂和ICSI-Y早期

5、胚胎的表達差異顯著(P＜0.05)。TET1高表達于SCNT-♂胚胎;TET2和TET3在早期胚胎低表達。H3K9me2高表達于IVF胚胎;H3K9me3顯著高表達于SCNT-♂的8cell期(P＜0.05)。
　　3.雌雄克隆胚胎印記基因的甲基化模式及調(diào)控研究
　　采用重亞硫酸鹽結(jié)合PCR法(Bisulfite Sequencing PCR，BSP)檢測Xist、H19、IGF2在雌雄克隆胚胎和來自于X、Y精子的IVF-X

6、、IVF-Y胚胎的甲基化狀態(tài)。結(jié)果顯示:Xist的甲基化水平在IVF-X、IVF-Y胚胎分別為44.8％和72.3％，在SCNT-♀胚胎甲基化狀態(tài)類似IVF-X胚胎，但在SCNT-♂胚胎甲基化水平為0％。H19和IGF2在這四組早期胚胎的甲基化水平變化為80％-94％。KDM4B顯著降低雌雄SCNT胚胎H3K9me3的表達且提高SCNT-♂胚胎的分裂率、囊胚率和SCNT-♀胚胎的分裂率（P＜0.05）。
　　4.雌雄水?？寺∨咛ビ?/p>

7、記基因的表達和調(diào)控
　　QRT-PCR檢測Xist、H19、IGF2在ICSI-X、ICSI-Y、SCNT-♀、SCNT-♂早期胚胎的表達情況。Xist-shRNA降低SCNT-♀胚胎Xist的表達以期提高克隆胚胎發(fā)育潛能。結(jié)果發(fā)現(xiàn):Xist高表達于各類胚胎的8cell(P＜0.05)，在各時期SCNT-♀胚胎的表達高于SCNT-♂胚胎（P＜0.05）;H19、IGF2高表達于SCNT的2cell和8cell(P＜0.05)。Xi

8、st-shRNA顯著降低SCNT-♀胚胎的Xist的表達及其囊胚率(P＜0.05)。
　　5.雌雄克隆水牛印記基因的甲基化和表達情況
　　采用BSP法和QRT-PCR法分別檢測印記基因Xist、H19、IGF2在雌雄的存活（♀L1-3，♂L1-3）、死亡克隆水牛（♀S1-3，♂S1-3）和普通水牛(♀N1-3，♂N1-3)耳部的甲基化和表達情況。結(jié)果顯示:(1)Xist基因甲基化水平在♀L組的與♀N組差異不顯著(P＞0.05

9、)，而♀S組顯著低于♀N組（P＜0.05）;在♂L、♂S和♂N組差異不顯著(P＞0.05)。(2)H19的甲基化水平在♀L、♀S和♀N以及♂L、♂S和♂N組差異不顯著（P＞0.05）。IGF2的甲基化水平在♀L、♀S和♀N以及♂L和♂N組差異不顯著（P＞0.05）。但♂S組顯著低于♂L和♂N組(P＜0.05)。(3)Xist的表達水平在♀S組顯著高于♀L和♀N組（P＜0.05），但♂S、♂L和♂N組無顯著差異（P＞0.05）;而H19、

10、IGF2在♀L和♀N以及♂L和♂N組無顯著差異(P＞0.05)，但在♀S和♂S組分別顯著高于♀L、♀N以及♂L、♂N組（P＜0.05）。
　　上述結(jié)果表明:(1)SCNT-♀胚胎的發(fā)育潛能高于SCNT-♂胚胎;(2)SCNT-♀胚胎的DNA甲基化水平低于SCNT-♂胚胎，且其Dnmts的轉(zhuǎn)錄模式和Xist的甲基化較于SCNT-♂胚胎趨于正常;(3)抑制H3K9me3的表達，促進SCNT胚胎的發(fā)育;(4)抑制Xist的表達，促進SC