1、肝癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，全球每年約有782，000新發(fā)病例。作為病死率第二位的惡性腫瘤，肝癌每年致746，000人死亡，其中一半以上的死亡病例發(fā)生在中國(guó)。乙肝病毒（Hepatitis B Virus，HBV）的感染是目前肝癌的主要的危險(xiǎn)因素。由于缺乏用于肝癌早期診斷的靈敏特異的生物標(biāo)志物，肝癌患者常常錯(cuò)過最佳治療期，臨床預(yù)后較差。目前最常見的用于肝癌診斷的生物標(biāo)志物為甲胎蛋白(Alhpa Feto Protein，AFP)，但

2、其在肝癌早期診斷中的價(jià)值較為有限。因此，尋找出新型的、高效的生物標(biāo)志物用于肝癌的早期診斷對(duì)于提高肝癌患者的治療效果及預(yù)后狀況具有重要意義。本研究主要內(nèi)容包括：
　　⑴利用TaqMan低密度表達(dá)芯片(TaqMan Low Density Array，TLDA)，1.組織樣本:(1)分別檢測(cè)HBV陽性的肝癌患者的肝癌組織、癌旁組織以及HBV陽性的肝炎肝硬化患者的肝炎組織（4例HBV陽性的肝癌病例和1例肝炎肝硬化病例）中miRNAs的表

3、達(dá)譜，通過兩兩比較差異表達(dá)的miRNAs，即為組織中與肝癌相關(guān)的miRNAs;2.血漿樣本:(1)分別檢測(cè)HBV陽性的肝癌患者術(shù)前的血漿與HBV陽性的肝炎肝硬化患者術(shù)前血漿中的miRNAs的表達(dá)譜，篩選出與肝癌相關(guān)的miRNAs（4例HBV陽性的肝癌患者術(shù)前血漿和1例肝炎肝硬化患者術(shù)前血漿）;(2)分別檢測(cè)HBV陽性的肝癌患者術(shù)前血漿與HBV陽性的肝癌患者術(shù)后血漿（4例HBV陽性的肝癌病例術(shù)前血漿與1例HBV陽性的肝癌病例切除術(shù)后血漿）

4、中的miRNAs表達(dá)譜，篩選出肝臟起源的miRNAs;(3)分別檢測(cè)HBV陽性的肝癌患者肝癌移植術(shù)前的血漿與移植術(shù)后血漿（3例HBV陽性的肝癌患者肝癌移植術(shù)前和移植術(shù)后的血漿）中的miRNAs的表達(dá)譜，將在肝臟移植術(shù)后患者血漿中表達(dá)上調(diào)的miRNAs剔除;通過上述策略，最終篩選出由肝臟起源的，與肝癌相關(guān)的10個(gè)循環(huán)miRNAs（miR-19a-3p、miR-19b-3p、miR-20a-5p、miR-25-3p、miR-30a-5p、m

5、iR-92a-3p、miR-132-3p,miR-185-5p、miR-320a和miR-324-3p）（在肝癌或?qū)φ罩斜磉_(dá)CT值低于35，且表達(dá)差異4倍以上）。
　?、仆ㄟ^對(duì)單個(gè)血漿樣本（患者/對(duì)照）進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR(RT-PCR)檢測(cè)10個(gè)miRNAs的表達(dá)情況，驗(yàn)證初篩的miRNAs;分為兩個(gè)部分(1)第一部分:在35例HBV陽性的肝癌患者及在年齡與性別匹配的50例HBV感染者的血漿中檢測(cè)miRNA表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)上述的10

6、個(gè)miRNAs在HBV陽性的肝癌患者血漿中表達(dá)水平均高于對(duì)照組(P＜0.05)，由于其中四個(gè)miRNAs（miR-19a-3p、miR-19b-3p、miR-20a-5p和miR-92a-3p）均位于腫瘤miRNA17-92簇中，且兩個(gè)miRNAs（miR-19a-3p和miR-19b-3p）與miR-20a-5p存在顯著相關(guān)。因此，在第二部分僅檢測(cè)了8個(gè)miRNAs(miR-20a-5p、miR-25-3p、miR-30a-5p、mi

7、R-92a-3p、 miR-132-3p、miR-185-5p、miR-320a和miR-324-3p)(2)第二部分:在32例HBV陽性的肝癌患者及32例HBV感染者的血漿中檢測(cè)8個(gè)miRNAs的表達(dá)水平，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)這8個(gè)miRNAs在HBV陽性的肝癌患者血漿中的表達(dá)水平均顯著高于對(duì)照組（所有P＜0.05）。為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)上述8個(gè)miRNAs在肝癌診斷中的應(yīng)用價(jià)值，我們基于上述樣本（即35例HBV陽性的肝癌患者和50例HBV感染者）進(jìn)行

8、參數(shù)估計(jì)，根據(jù)受試者工作特征曲線(Receiver OperatorCharacteristic Curve，ROC)來確定各個(gè)miRNA的最佳診斷界值，在確認(rèn)最佳診斷臨界值后，進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分(s=0/1).根據(jù)Logistic回歸分析的回歸方程中的回歸系數(shù)來確定各個(gè)miRNA在miRNAs組合中的權(quán)重，以風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分為基礎(chǔ)以及各自對(duì)應(yīng)的miRNA權(quán)重來對(duì)每例樣本的危險(xiǎn)分值(RSF)進(jìn)行估計(jì)。結(jié)果顯示，上述的8個(gè)miRNAs組合的AUC為0.

9、823（靈敏度82.9％，特異度74.0％）。然后，應(yīng)用第二階段第一部分確定的最佳診斷界值在第二階段的第二部分樣本中評(píng)價(jià)了8個(gè)miRNAs的診斷價(jià)值，該階段的結(jié)果顯示8個(gè)miRNAs組合的AUC為0.780（靈敏度78.1％，特異度68.7％）;兩部分合并的AUC為0.802（靈敏度86.6％，特異度74.0％）。
　?、菫榱颂接懞Y選出的miRNA是否具有早期診斷的價(jià)值，我們進(jìn)行了巢式病例對(duì)照研究。兩個(gè)前瞻性隊(duì)列分別位于江蘇常州以

10、及江蘇啟東。其中江蘇常州隊(duì)列，截止2013年11月，有20例HBV陽性的肝癌患者，我們?cè)陉?duì)列中選取了基線資料匹配的40例HBV感染者為對(duì)照;江蘇啟東隊(duì)列截止2003年12月，有667例HBV陽性的肝癌患者，隨機(jī)選取其中50例作為病例組，在未發(fā)病HBV感染者中隨機(jī)選取37人作為對(duì)照。在上述總計(jì)147例樣本中檢測(cè)了11個(gè)miRNAs的表達(dá)情況（8個(gè)miRNAs以及文獻(xiàn)報(bào)道且與我們TLDA芯片篩選結(jié)果方向一致的3個(gè)miRNAs分別為miR-1

11、92-5p、miR-21-5p和miR-375）。采用meta分析合并兩個(gè)隊(duì)列的數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)其中4個(gè)miRNAs（miR-20a-5p、miR-320a、miR-324-3p和miR-375）在肝癌患者中的表達(dá)水平顯著高于對(duì)照(Pmeta＜0.05)。為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)篩選出的這4個(gè)miRNAs(miR-20a-5p、miR-320a、miR-324-3p和miR-375)在肝癌早期診斷中的價(jià)值。我們聯(lián)合AFP結(jié)果，在常州隊(duì)列和啟東隊(duì)列中分別

12、利用ROC曲線確定每一個(gè)miRNAs及AFP的最佳臨界值，然后對(duì)每一個(gè)個(gè)體的表達(dá)值進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分，同樣利用ROC曲線確定最佳臨界值，以最佳臨界值為依據(jù)將個(gè)體評(píng)為危險(xiǎn)1或者不危險(xiǎn)0。使用Logistic回歸分析對(duì)每個(gè)miRNA與肝癌發(fā)病的關(guān)聯(lián)進(jìn)行評(píng)估。我們發(fā)現(xiàn)，4個(gè)miRNAs在常州隊(duì)列中的AUC為0.768（靈敏度65.0％，特異度77.5％，陽性預(yù)測(cè)值59.1％，陰性預(yù)測(cè)值81.6％），AFP的AUC為0.575（靈敏度15.0％，特異

13、度100.0％，陽性預(yù)測(cè)值100.0％，陰性預(yù)測(cè)值70.2％）;miRNAs與AFP合并的AUC為0.789（靈敏度70.0％，特異度77.5％，陽性預(yù)測(cè)值60.9％，陰性預(yù)測(cè)值83.3％）;在啟東隊(duì)列中，4個(gè)miRNAs的AUC為0.706（靈敏度56.0％，特異度83.3％，陽性預(yù)測(cè)值82.4％，陰性預(yù)測(cè)值58.5％），AFP的AUC為0.579(靈敏度16.0％，特異度100.0％，陽性預(yù)測(cè)值100.0％，陰性預(yù)測(cè)值46.8％);

14、miRNAs與AFP合并的AUC為0.767（靈敏度64.0％，特異度83.8％，陽性預(yù)測(cè)值84.2％，陰性預(yù)測(cè)值63.3％）。
　　⑷本次研究利用肝臟組織與血漿樣本共同篩選，得到來源于肝臟且與肝癌相關(guān)的10個(gè)血漿miRNAs。在肝癌的診斷方面，我們發(fā)現(xiàn)其中8個(gè)miRNAs在HBV陽性的肝癌患者中顯著高表達(dá)，通過評(píng)估診斷價(jià)值后，發(fā)現(xiàn)這8個(gè)血漿miRNAs具有較好的診斷價(jià)值。在早期診斷方面的，通過巢式病例-研究對(duì)照研究，在兩個(gè)獨(dú)立的