1、石磺科貝類是在海水、淡水、陸地都有分布的一類生物，它們的生活區(qū)域分布于淺海、灘涂潮間帶甚至潮上帶，生活環(huán)境具有典型的兩棲性，其皮膚呼吸能力的強(qiáng)弱、肌肉的結(jié)構(gòu)、角質(zhì)層的形成和神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育程度因生活環(huán)境的不同表現(xiàn)出明顯的生物適應(yīng)性，因此石磺科貝類又被認(rèn)為是海洋無(wú)脊椎動(dòng)物從水生到陸生進(jìn)化的過(guò)渡類群。為探究肌肉在石磺由海洋向陸地進(jìn)化過(guò)程中發(fā)揮作用的分子機(jī)制，探討其在該過(guò)程中產(chǎn)生的適應(yīng)性進(jìn)化，本論文以我國(guó)分布廣泛且研究較為深入的4種石磺作為實(shí)驗(yàn)

2、對(duì)象，以已有的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)為基礎(chǔ)，比較分析后篩選、克隆了石磺肌肉相關(guān)基因，分析在不同種石磺、各組織中的表達(dá)狀態(tài)，并對(duì)4種石磺進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行了初步探討。
　　(1)采用RACE方法從瘤背石磺（Onchidium struma）肌肉中首次克隆到MSTN cDNA的全長(zhǎng)并做了相應(yīng)的組織表達(dá)分析。研究結(jié)果表明瘤背石磺 MSTN基因cDNA全長(zhǎng)2667bp，5′-非翻譯區(qū)（5′-UTC）的長(zhǎng)度為374bp，3′端非翻譯區(qū)（3′-UTC）的長(zhǎng)度

3、為643bp，1650bp的開放閱讀框（ORF），對(duì)應(yīng)編碼549個(gè)氨基酸。預(yù)測(cè)該基因編碼的蛋白質(zhì)原子總量為8776，分子式為 C2774H4331N783O862S26，分子質(zhì)量約為63.27kD，理論等電點(diǎn)為6.02，信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果顯示MSTN蛋白N端具有21個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的信號(hào)肽。瘤背石磺MSTN具有MSTN的共同特征，包括蛋白酶水解位點(diǎn)RSRR和C端多肽生物活性區(qū)以及9個(gè)保守的半胱氨酸殘基。系統(tǒng)發(fā)生樹分析結(jié)果顯示瘤背石磺MSTN與加

4、州海兔MSTN的親緣關(guān)系最近。RT-PCR結(jié)果顯示，MSTN基因在各個(gè)組織中均有表達(dá)；含肌纖維組織中的表達(dá)量低于內(nèi)臟器官的表達(dá)量，在瘤背石磺肝胰腺中的表達(dá)量最高，瘤背石磺腹足中表達(dá)量最低(P＜0.05)。
　　(2)以石磺科4種貝類轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，瘤背石磺（Onchidium struma）、里氏擬石磺（Paraoncidium reevesii）、平疣桑椹石磺（Platevindex mortoni）、紫色疣石磺（Peroni

5、a verruculata）為實(shí)驗(yàn)材料克隆了4種石磺的MyHC基因的編碼區(qū)全長(zhǎng)并進(jìn)行了分析，結(jié)果表明瘤背石磺MyHC基因cDNA全長(zhǎng)7566bp，開放閱讀框?yàn)?895bp，對(duì)應(yīng)編碼1964個(gè)氨基酸，同時(shí)包括228bp的5’端非翻譯區(qū)，1443bp的3’端非翻譯區(qū)。預(yù)測(cè)瘤背石磺MyHC基因編碼的蛋白質(zhì)由31713個(gè)原子組成，分子式為C9765H15897N2849O3150S52，相對(duì)分子量約為225.28kD，理論等電點(diǎn)為5.56，信號(hào)

6、肽預(yù)測(cè)結(jié)果表明瘤背石磺MyHC蛋白 N端具有29個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的信號(hào)肽。瘤背石磺MyHC具有兩個(gè)保守結(jié)構(gòu)域MYSc_class_Ⅱ和Myosin_tail_l，且親水性氨基酸集中在Myosin_tail_l。里氏擬石磺MyHC的cDNA全長(zhǎng)7598bp，包括5904bp的開放閱讀框，對(duì)應(yīng)編碼1967個(gè)氨基酸，276bp的5′端非翻譯區(qū)，1418bp的3′端非翻譯區(qū),預(yù)測(cè)編碼蛋白原子總量31713，分子式為 C9765H15894N2860

7、O3156S56；平疣桑椹石磺MyHC的cDNA全長(zhǎng)7115bp，預(yù)測(cè)開放閱讀框?yàn)?904bp，預(yù)測(cè)編碼1967個(gè)氨基酸，5′-UTC為165bp，3′-UTC為1046bp，預(yù)測(cè)編碼蛋白原子總量31776，分子式為C9785H15921N2865O3153S52；紫色疣石磺MyHC的cDNA全長(zhǎng)7115bp，預(yù)測(cè)ORF為5904bp，對(duì)應(yīng)編碼1967個(gè)氨基酸，192bp的5′-UTC，1059bp的3′-UTC，預(yù)測(cè)編碼蛋白原子總量3

8、1730，分子式為C9762H15895N2859O3157S57。石磺科貝類MyHC具有兩個(gè)保守結(jié)構(gòu)域MYSc_class_Ⅱ和Myosin_tail_l，且親水性氨基酸集中在Myosin_tail_l。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)深入研究石磺肌球蛋白重鏈基因的原位雜交實(shí)驗(yàn)、western blot檢測(cè)奠定了基礎(chǔ)。
　?。?）為探究石磺科貝類肌肉相關(guān)基因在各組織中的表達(dá)差異，分別取瘤背石磺的背部皮膚、腹部皮膚、腹足、肺囊、肝胰腺、口球、兩性腺、

9、蛋白腺8個(gè)組織以及里氏擬石磺、平疣桑椹石磺、紫色疣石磺的背部皮膚、腹部皮膚、腹足、肺囊4個(gè)組織進(jìn)行熒光定量檢測(cè)。MyHC基因在4種石磺不同組織中的熒光定量結(jié)果顯示：背部皮膚中，瘤背石磺的表達(dá)量最高，里氏擬石磺表達(dá)量最低，且表達(dá)差異顯著；腹部皮膚中，平疣桑椹石磺表達(dá)量最高；腹足中平疣桑椹石磺表達(dá)量最高，瘤背石磺次之，里氏擬石磺表達(dá)量最低，表現(xiàn)出顯著差異；肺囊中整體表達(dá)量低，瘤背石磺表達(dá)量最高，未出現(xiàn)顯著性差異。瘤背石磺MSTN、MyHC基