1、研究背景:
　　 膀胱癌是常見(jiàn)的腫瘤()并呈逐年上升的趨勢(shì)()存活率不高，因此對(duì)這類病人，臨床上迫切需要新的治療手段。
　　 膀胱癌雖然不是傳統(tǒng)意義上的內(nèi)分泌依賴性腫瘤，但近年來(lái)的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，膀胱癌的發(fā)病與進(jìn)展與多種類固醇激素及其受體密切相關(guān)。有研究指出，長(zhǎng)期使用糖皮質(zhì)激素可引起膀胱癌發(fā)病率升高，但給出的解釋是糖皮質(zhì)激素導(dǎo)致的免疫抑制[14]。對(duì)于糖皮質(zhì)激素是否直接通過(guò)其受體通路影響膀胱癌的發(fā)病與進(jìn)展，目前仍無(wú)相關(guān)的系

2、統(tǒng)性研究。
　　 糖皮質(zhì)激素(GC)是由腎上腺皮質(zhì)中束狀帶分泌的一類類固醇激素，受促腎上腺皮質(zhì)激素調(diào)節(jié)，對(duì)細(xì)胞的一系列生物學(xué)過(guò)程，如增殖、分化、凋亡等，都有重要的調(diào)節(jié)作用，其生物學(xué)效應(yīng)需通過(guò)其受體(GR)介導(dǎo)。
　　 近年有關(guān)糖皮質(zhì)激素受體(GR)與多種血液系統(tǒng)及實(shí)體腫瘤的發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)研究以及應(yīng)用主要集中在以下幾個(gè)方面:
　　 1，GR可有效的誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡，目前是急性淋巴細(xì)胞白血病的化療基本用藥。而一旦

3、腫瘤細(xì)胞的GR發(fā)生變異，常常就意味著化療失敗，預(yù)后不良;
　　 2，體外研究證實(shí)在骨肉瘤中，GC與其受體作用可抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)凋亡，增強(qiáng)細(xì)胞間相互粘附;
　　 3，小細(xì)胞肺癌中GR過(guò)表達(dá)可以導(dǎo)致腫瘤生長(zhǎng)緩慢，細(xì)胞凋亡增加，而GR失表達(dá)可令腫瘤細(xì)胞逃避糖皮質(zhì)激素引起的凋亡反應(yīng);
　　 4，在前列腺癌中，糖皮質(zhì)作用可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡增加、細(xì)胞周期停滯、增殖減緩。在體內(nèi)試驗(yàn)中GC可通過(guò)GR抑制前列腺癌新生血管和

4、淋巴管的形成，GR可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡;
　　 有充分的數(shù)據(jù)說(shuō)明糖皮質(zhì)激素受體通路活躍程度與多種腫瘤預(yù)后有關(guān)，但膀胱癌與糖皮質(zhì)激素受體的相關(guān)性，仍是一個(gè)新的領(lǐng)域，我們擬對(duì)此展開(kāi)初步研究。研究目標(biāo)
　　 從分子、細(xì)胞和臨床層面上探討糖皮質(zhì)激素及其受體在膀胱癌增殖與轉(zhuǎn)移中可能的作用及其伴行機(jī)制，為膀胱癌治療探索新的思路。
　　 1第一部分GR在膀胱癌中的表達(dá)、生物學(xué)活性鑒定及臨床病理聯(lián)系
　　 1.1研究?jī)?nèi)容:

5、
　　 通過(guò)對(duì)臨床標(biāo)本與已有膀胱癌細(xì)胞株的檢測(cè)，了解膀胱癌中GR的表達(dá)及其與腫瘤分級(jí)、分期、轉(zhuǎn)移、預(yù)后的相關(guān)性。
　　 1.2實(shí)驗(yàn)方法:
　　 1.2.1人膀胱癌組織中GR表達(dá)及臨床病理關(guān)系
　　 組織檢測(cè):在組織芯片中對(duì)膀胱癌癌組織，癌旁組織、轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)行免疫組織化學(xué)染色，分析上述組織中GR，表達(dá)的陽(yáng)性率、陽(yáng)性強(qiáng)度的差異，探討GR變化與膀胱癌TNM分期、分級(jí)、術(shù)后復(fù)發(fā)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、及預(yù)后的關(guān)系。

6、　　 1.2.2 GR高表達(dá)膀胱癌細(xì)胞株的篩選與穩(wěn)定GR knock-down細(xì)胞株的建立
　　 1)膀胱癌細(xì)胞株中GR的表達(dá):4株膀胱癌細(xì)胞株5637，J82，TCC-SUP和UMUC3應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄PCR(Reverse Transcription PCR，RT-PCR)和westernblot在mRNA和蛋白兩個(gè)層面檢測(cè)GR的表達(dá)。
　　 2)膀胱癌細(xì)胞株中GR的功能:共轉(zhuǎn)染MMTV-luc報(bào)告質(zhì)粒和PRL-TK-l

7、uc內(nèi)對(duì)照質(zhì)粒入待檢細(xì)胞株，熒光素酶分析(luciferase assay)評(píng)價(jià)各細(xì)胞株中GR功能。
　　 3)嘌呤霉素(Puromicin)篩選，建立高活性穩(wěn)定表達(dá)GR-shRNA細(xì)胞株，用RT-PCR，Western blot確認(rèn)表達(dá)，細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，傳代備用。
　　 1.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　 1.3.1所檢測(cè)膀胱癌細(xì)胞株、組織芯片中膀胱癌、正常尿路上皮、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌均100％表達(dá)GR
　　 在4株膀胱癌

8、細(xì)胞株UMUC3、TCC-SUP、J82、5637中，RT-PCR和Western-blotting檢測(cè)了GR均為陽(yáng)性。在膀胱組織芯片中，所有的正常膀胱尿路上皮、尿路上皮癌、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌均100％表達(dá)GR。
　　 1.3.2 GR在4株膀胱癌細(xì)胞株中均有生理學(xué)活性
　　 熒光素酶分析法檢測(cè)了各不同細(xì)胞株中GR的生物學(xué)活性，地塞米松作用后，細(xì)胞中熒光素酶活性的增長(zhǎng)倍數(shù)依次為UMUC3(23.6倍)，TCC-SUP（14.9

9、倍），5637(3.1倍)，J82（1.4倍）。糖皮質(zhì)激素受體拮抗劑RU-486對(duì)地塞米松(Dexamethasone，DXM)引起的GR活性激發(fā)有很好的拮抗作用。
　　 1.3.3成功建立了GR基因沉默的穩(wěn)定細(xì)胞株
　　 對(duì)建立的穩(wěn)定GR knock-down細(xì)胞株進(jìn)行了GR表達(dá)與轉(zhuǎn)錄活性兩方面的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn):(1)GR-shRNA穩(wěn)定感染后 UMUC-3-GR-shRNA(U-sh)和TCC-SUP-GR-shRNA(

10、T-sh)中的GR表達(dá)均較其父系細(xì)胞株UMUC-3-control(U-C)和TCC-SUP-control(T-C)顯著下降;(2)UMUC-3-GR-shRNA(U-sh)和TCC-SUP-GR-shRNA(T-sh)中的GR轉(zhuǎn)錄活性顯著下降。
　　 1.4小結(jié):
　　 (1)正常膀胱尿路上皮、尿路上皮癌、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌均100％表達(dá)GR。
　　 (2)糖皮質(zhì)激素受體拮抗劑RU-486對(duì)DXM（地塞米松）引起的

11、GR活性激發(fā)有很好的拮抗作用。
　　 (3)穩(wěn)定GR knock-down的細(xì)胞株，其GR表達(dá)較其父系細(xì)胞株UMUC-3-control(U-C)和T-CC-SUP-control(T-C)顯著下降;而轉(zhuǎn)錄活性也較UMUC-3-GR-shRNA(U-sh)和TCC-SUP-GR-shRNA(T-sh)中的GR轉(zhuǎn)錄活性顯著下降。
　　 2第二部分GC/GR通路對(duì)膀胱癌增殖及侵襲能力的影響及機(jī)制——體外實(shí)驗(yàn)
　　 2

12、.1研究?jī)?nèi)容:
　　 利用短發(fā)卡RNA（short hairpin RNA，shRNA）基因封閉技術(shù)研究GR低表達(dá)膀胱癌細(xì)胞株與其父系GR高表達(dá)膀胱癌細(xì)胞株之間體外培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)、侵襲能力的變化與分子機(jī)制以及對(duì)GC與GR拮抗劑的不同反應(yīng)。
　　 2.2實(shí)驗(yàn)方法:
　　 2.2.1 GR對(duì)膀胱癌細(xì)胞增殖、分化、侵襲與轉(zhuǎn)移能力的影響
　　 1)細(xì)胞增殖，凋亡與細(xì)胞周期:MTT assay分析細(xì)胞增殖，TUNE

13、L assay分析凋亡，流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期;結(jié)合定量PCR(Quantitive PCR, q-PCR)和western-blot分析cycline D1/D2/D3，細(xì)胞周期素依賴激酶(CyclineDependent Kinase，CDK) CDK2/CDK4/CDK6，P21/P27等細(xì)胞周期調(diào)節(jié)分子，Caspase3等凋亡調(diào)節(jié)分子的表達(dá)。
　　 2)腫瘤細(xì)胞侵襲能力:Transwell小室模型評(píng)價(jià)腫瘤細(xì)胞侵襲能力，明

14、膠酶譜(Gel Zymography)檢測(cè)基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix Metalloproteinase，MMP)MMP2/MMP9活性變化;結(jié)合q-PCR和western-blot分析MMP2/MMP9、白介素(Interleukin，IL) IL-6、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VascularEndothelial Growth Factor, VEGF)等關(guān)鍵蛋白的表達(dá)。
　　 3)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（Epithelial-Mese

15、nchymal Transition，EMT）分析:顯微鏡下觀察體外培養(yǎng)條件下DXM和RU486對(duì)膀胱癌細(xì)胞形態(tài)的影響，應(yīng)用Image-J軟件對(duì)細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行分析（面積、周長(zhǎng)、圓度），判斷腫瘤細(xì)胞的上皮樣/間質(zhì)樣形態(tài)傾向性;q-PCR或western-blot分析E-Cadherin、N-Cadherin、β-Catenin、 Vimentin、Snail等關(guān)鍵分子的表達(dá)。
　　 2.2.2 GR對(duì)NFkB信號(hào)通路的調(diào)控功能

16、>　　 1) GR對(duì)NFkB信號(hào)通路關(guān)鍵分子表達(dá)的影響:Western-blot檢測(cè)原始膀胱癌細(xì)胞株與GR knock-down細(xì)胞株中地塞米松(Dexamethasone，DXM)和GR拮抗劑RU486對(duì)NFkB主要成員Rel A和其主要抑制蛋白IkBα表達(dá)的影響。
　　 2) GR對(duì)NFkB信號(hào)分子入核的影響:免疫熒光方法分別標(biāo)記GR、 RelA蛋白，觀察DXM及RU486作用對(duì)GR和RelA核內(nèi)轉(zhuǎn)位的影響;分別提取核、漿

17、蛋白，評(píng)價(jià)DXM、RU486作用對(duì)GR、Rel A蛋白核漿分布比例的影響。
　　 3)免疫共沉淀分析GR與Rel A是否直接結(jié)合，分析不同DXM/RU486作用條件下Rel A與IkBα結(jié)合情況，評(píng)價(jià)GR通路對(duì)NFkB通路活化/抑制情況的影響。
　　 2.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　 2.3.1 GC/GR通路激活在體外誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞周期停滯、同時(shí)抑制凋亡
　　 DXM導(dǎo)致膀胱癌細(xì)胞株細(xì)胞周期G1停滯，同時(shí)抑制凋亡

18、。DXM作用后CDK抑制因子P27/P21呈濃度依賴性上升;凋亡效應(yīng)分子cleaved caspase-3表達(dá)下降;RU-486拮抗DXM作用;在表達(dá)GR-shRNA的細(xì)胞株中，DXM作用明顯減弱。
　　 2.3.2 GC/GR通路激活抑制膀胱癌細(xì)胞侵襲能力
　　 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在UMUC-3和TCC-SUP細(xì)胞株中，DXM顯著降低細(xì)胞侵襲能力。DXM可以在UMUC3/TCC-SUP細(xì)胞株降低MMP-2、

19、MMP-9、IL-6和VEGF的mRNA表達(dá)豐度。明膠酶譜分析結(jié)果，DXM降低膀胱癌細(xì)胞中MMP-2/MMP-9活性。RU-486和GR-shRNA拮抗DXM的作用。
　　 2.3.3 DXM導(dǎo)致膀胱癌細(xì)胞間質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化
　　 DXM作用后，腫瘤細(xì)胞表面積、周長(zhǎng)、圓度、似圓率均顯著增加;Western-blotting實(shí)驗(yàn)，DXM作用后，膀胱癌細(xì)胞的上皮方向分化的蛋白分子標(biāo)記物表達(dá)上升，間質(zhì)標(biāo)記物下降，與形態(tài)學(xué)變化相符。

20、RU-486和GR-shRNA拮抗DXM的作用。
　　 2.3.4 DXM對(duì)NFkB通路的影響
　　 DXM對(duì)NFkB本身表達(dá)無(wú)影響，但明顯上調(diào)NFkB的主要拮抗蛋白IkBa的表達(dá)水平;DXM顯著上調(diào)NFkB和IkBa免疫共沉淀;胞內(nèi)NFkB的定位研究，DXM可以導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)NFkB出核。RU-486和GR-shRNA明顯減弱上述效應(yīng)。
　　 2.4小結(jié):
　　 (1) GC/GR通路激活在體外誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)

21、胞周期停滯、同時(shí)抑制凋亡;
　　 (2) Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，DXM顯著降低細(xì)胞侵襲能力;
　　 (3) Western-blotting實(shí)驗(yàn)，顯示DXM作用后可使膀胱癌細(xì)胞的上皮方向分化的蛋白分子標(biāo)記物表達(dá)上升，間質(zhì)標(biāo)記物下降，引致腫瘤細(xì)胞表面積、周長(zhǎng)、圓度、似圓率均顯著增加;
　　 (4) DXM可明顯上調(diào)NFkB的主要拮抗蛋白IkBa的表達(dá)水平;顯著上調(diào)NFkB和IkBa的免疫共沉淀;并可導(dǎo)致細(xì)

22、胞內(nèi)NFkB出核。RU-486和GR-shRNA明顯減弱上述效應(yīng)。
　　 上述研究結(jié)果表明:
　　 膀胱癌中GC/GR通路激活可誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯，抑制凋亡;并明顯抑制侵襲與轉(zhuǎn)移。但未能抑制細(xì)胞的增殖，其原因和機(jī)制有待進(jìn)一步探討。
　　 3第三部分GC/GR通路對(duì)膀胱癌腫瘤生物學(xué)行為影響動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
　　 3.1研究?jī)?nèi)容:
　　 構(gòu)建嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷(Severe combined immunodefi

23、ciency，SCID)小鼠皮下荷瘤模型，觀察不同克隆細(xì)胞、不同藥物作用情況下的成瘤和侵襲、轉(zhuǎn)移情況，探討GR/GC信號(hào)通路與膀胱癌生物學(xué)行為的關(guān)系。
　　 3.2實(shí)驗(yàn)方法:
　　 SCID小鼠荷瘤模型的建立與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)
　　 1)在SCID小鼠皮下注射對(duì)照膀胱癌細(xì)胞株或GR knock-down細(xì)胞株1×106/位點(diǎn)。營(yíng)造荷瘤小鼠模型成功后，待所有腫瘤體積達(dá)到40mm3，實(shí)驗(yàn)組皮下埋植DXM緩釋藥丸（0.5mg

24、DXM/90天），對(duì)照組植入空白藥丸，觀察其對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響。
　　 2)最大腫瘤達(dá)到荷瘤小鼠體重1/10為實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)，觀察腫瘤局部浸潤(rùn)、腹水產(chǎn)生、腹腔轉(zhuǎn)移瘤形成情況，常規(guī)蘇木素-伊紅染色確定。取腫瘤組織免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)Ki67表達(dá)，評(píng)價(jià)腫瘤增殖指數(shù);TUN-EL法檢測(cè)凋亡，評(píng)織化學(xué)方法檢測(cè)Ki67表達(dá)，評(píng)價(jià)腫瘤增殖指數(shù);TUNEL法檢測(cè)凋亡，評(píng)價(jià)DXM對(duì)凋亡影響;CD34標(biāo)記血管內(nèi)皮細(xì)胞，行微血管密度(Microvessel

25、Density，MVD)記數(shù)，結(jié)合VEGF標(biāo)記，評(píng)價(jià)新生血管形成能力。
　　 3.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　 3.3.1 SCID荷瘤小鼠模型中GC/GR通路上調(diào)對(duì)膀胱癌生長(zhǎng)的影響
　　 經(jīng)DXM治療的UMUC-3-control組平均腫瘤體積較其它三組稍有增大，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;無(wú)藥物作用的UMUC-3-shRNA組略低于無(wú)藥物作用的UMUC-3-control組，DXM治療的UMUC-3-shRNA略高于無(wú)藥物作用的U

26、MUC-3-shRNA組，均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 3.3.2 SCID荷瘤小鼠模型中GC/GR通路上調(diào)對(duì)膀胱癌的侵襲與轉(zhuǎn)移影響
　　 無(wú)藥物作用的小鼠中，7例(88％)發(fā)現(xiàn)血性腹水，4例(50％)發(fā)現(xiàn)腹腔轉(zhuǎn)移瘤，DXM治療小鼠中，無(wú)一例有血性腹水或腹腔轉(zhuǎn)移瘤發(fā)生;DXM治療的UMUC-3-control組腫瘤中未發(fā)現(xiàn)腫瘤對(duì)周邊骨骼肌的浸潤(rùn)，其它3組均有不同程度的腫瘤周邊肌肉侵犯。
　　 3.3.3 SCID荷瘤小

27、鼠模型中腫瘤的分子免疫學(xué)改變
　　 DXM治療的UMUC-3-control組腫瘤Ki-67略高于其它3組，凋亡(TUNEL)低于其它三組，腫瘤侵襲與血管生成相關(guān)分子表達(dá)（MMP-9/VEGF/CD34）低于其它3組。
　　 3.4小結(jié):
　　 (1)經(jīng)DXM治療的荷瘤小鼠模型平均腫瘤體積較其它三組稍有增大，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;
　　 (2)經(jīng)DXM治療小鼠中，無(wú)一例有血性腹水或腹腔轉(zhuǎn)移瘤發(fā)生;也未發(fā)現(xiàn)腫瘤對(duì)

28、周邊骨骼肌的浸潤(rùn)，而無(wú)藥物作用的小鼠中，7例(88％)發(fā)現(xiàn)血性腹水，4例(50％)發(fā)現(xiàn)腹腔轉(zhuǎn)移瘤，并均有不同程度的腫瘤周邊肌肉侵犯。
　　 (3) DXM治療可降低腫瘤侵襲與血管生成相關(guān)分子表達(dá)。
　　 研究結(jié)論:
　　 1) GR在膀胱癌有100％表達(dá)，GR高表達(dá)可能提示腫瘤預(yù)后良好;
　　 2) GC/GR通路激活誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞周期停滯，同時(shí)抑制凋亡;
　　 3) GC/GR通路激活明顯抑制膀