1、目的： 人類免疫缺陷病毒(HIV)主要侵犯免疫系統(tǒng)的重要細胞CD4+T細胞，造成機體免疫功能下降，最終因患各種機會性感染或腫瘤而死亡。 本研究首次應(yīng)用多色流式細胞分析技術(shù)，對34例HIV感染者/AIDS病人、20例HAART治療者及22例HIV抗體陰性正常對照的NK細胞表面活化受體NKG2D、抑制受體NKG2A、KIR3DL1同時進行檢測，研究HIV感染對不同NK細胞亞群上活化受體及抑制受體表達的影響，以及抗病毒治療后活

2、化受體及抑制受體的表達情況。 方法： 1、研究對象 來自中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院紅絲帶門診的34例未經(jīng)抗病毒治療(HAART)的HIV感染者/AIDS病人，其中HIV感染組(HIV組)24例(CD4+T細胞介于200-500個/μl之間，無艾滋病指征性疾病)，男性18例，女性6例，年齡分布為28-58歲(41.5±8.3)；AIDS病人組(AIDS組)10例(CD4+T細胞<200個/μl或出現(xiàn)艾滋病指征性疾病)

3、，其中男性6例，女性4例，年齡分布為35-68歲(48.2±4.6)。HAART治療者20例。 2、T細胞絕對值檢測 將20μlBD公司CD4FITC/CD8PE/CD3PerCP試劑加入TruCOUNT管中，經(jīng)逆向加樣法加入50μl抗凝全血，室溫避光15min，加入1×免洗溶血素450μl，室溫避光15min，應(yīng)用FACSCalibur流式細胞儀上樣檢測，MULTISET軟件自動分析，計算CD3+/CD3+CD4+/C

4、D3+CD8+T淋巴細胞絕對值。 3、NK細胞各亞群NKG2D、NKG2A、KIR3DL1的檢測 在兩流式管中分別加入五色抗體CD3-FITC6μl/CD16-Percp-Cy5.56μl/CD56-PE-Cy73μl/NKG2D-APC5μl/NKG2A-PE10μl和五色抗體CD3-FITC6ul/CD16-Percp-Cy5.56μl/CD56-PE-Cy73μl/NKG2D-APC5μl/KIR3DL1-PE10

5、μl，在兩管中各加入100μl抗凝全血，室溫避光25min。加入溶血素3ml，室溫避光8min，330g離心5min，棄上清。加入3mlPBS重懸，室溫，330g離心5min，棄上清，共洗滌兩次。加入1％多聚甲醛的PBS200μl重懸，應(yīng)用FACSAria流式細胞儀上樣檢測，BDFACSDivaTM軟件進行分析。首先，以淋巴細胞為門選定CD3-淋巴細胞，再以CD3-淋巴細胞為門，定義出由CD3-CD56-CD16+、CD3-CD56di

6、mCD16+、CD3-CD56briCD16+/-三種NK細胞亞群構(gòu)成的總NK細胞，然后分析每個NK細胞亞群占總NK細胞的百分比，并且同時檢測各亞群表面活化受體、抑制受體表達水平。 4、HIV病毒載量測定 以200μl血漿采用標準版模板制備法提取RNA，采用Roche公司HIV-1Monitor1.5commercialkit在COBASAMPLICOR自動載量儀上以RT-PCR方法測定病毒載量。檢測范圍為400-750

7、，000copies/ml。 5、統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS11.5軟件包進行統(tǒng)計分析，全部數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差表示。經(jīng)數(shù)據(jù)檢驗為偏態(tài)分布、方差不齊者，進行對數(shù)轉(zhuǎn)化后均為正態(tài)分布且方差齊。各組間實驗指標的比較采用方差分析，相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)檢驗，P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)果： 1、HIV感染者、AIDS病人、HAART治療者NK細胞亞群構(gòu)成情況 與正常對照相比，HIV組、AID

8、S組CD56-CD16+NK細胞的百分比顯著升高(P＜0.01)，CD56dimCD16+NK細胞的百分比顯著降低(P＜0.01)，CD56briCD16+/-NK細胞的百分比顯著升高(P＜0.01)，這三個亞群的百分比在HIV組與AIDS組之間均無明顯差異；HAART治療組與HIV組、AIDS組之間無統(tǒng)計學(xué)差異。 2、單獨研究NK細胞各亞群活化受體、抑制受體表達情況 (1)CD56dimCD16+NK細胞表面NKG2D

9、、NKG2A、KIR3DL1的表達水平NKG2D的表達水平在HIV組與正常對照之間無顯著差異，AIDS組顯著低于正常對照組，且顯著低于HIV組(P＜0.05)；HAART治療組顯著高于AIDS組(P＜0.05)。NKG2A、KIR3DL1的表達水平在各組間均無顯著差異。 (2)CD56briCD16+/-NK細胞表面NKG2D、NKG2A、KIR3DL1的表達水平KIR3DL1的表達水平在HIV組顯著低于正常對照(P＜0.05)

10、；其余各組間無統(tǒng)計學(xué)差異。 3、同時研究NK細胞各亞群活化受體、抑制受體表達情況 (1)在CD56dimCD16+NK細胞表面的表達水平NKG2D+KIR3DL1+的NK細胞水平在HIV組、AIDS組明顯均低于正常對照組(P＜0.01)；HAART治療組與各組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義；HIV組、AIDS組之間無顯著差異。 (2)在CD56briCD16+/-NK細胞表面的表達水平NKG2D+KIR3DL1-的NK細胞

11、水平在HIV組明顯高于正常對照組(P<0.01)，AIDS組明顯低于HIV組(P<0.05)；其余各組間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。NKG2A+NKG2D+、NKG2D+KIR3DL1+、NKG2D+NKG2A-、NKG2D-NKG2A+、NKG2D-KIR3DL1+的NK細胞水平在各組之間均無顯著差異。 (3)在CD56-CD16+NK細胞表面的表達水平NKG2D+NKG2A+的NK細胞水平在HIV組明顯高于正常對照組(P<0.01)

12、，AIDS組與正常對照間無統(tǒng)計學(xué)差異，HAART治療組與正常對照組間無明顯差異，顯著低于HIV組(P<0.01)，與AIDS組之間無顯著差異；AIDS組顯著低于HIV組(P<0.01)。 4、活化受體、抑制受體表達水平與CD4+T細胞和病毒載量的相關(guān)性分析CD56dimCD16+NK細胞亞群的活化受體、抑制受體表達水平與CD4+T細胞和病毒載量的相關(guān)性。 (1)NKG2D-NKG2A+表達水平與CD4+T細胞和病毒載量的

13、相關(guān)性HIV感染者、AIDS病人NKG2D-NKG2A+的NK細胞水平與CD4+T細胞顯著負相關(guān)(r=-0.42，P<0.05)，與病毒載量顯著正相關(guān)(r=0.37，P<0.05)。 (2)NKG2D-KIR3DL1+表達水平與CD4+T細胞和病毒載量的相關(guān)性HIV感染者、AIDS病人NKG2D-KIR3DL1+的NK細胞水平與CD4+T細胞顯著負相關(guān)(r=-0.55，P<0.05)，與病毒載量顯著正相關(guān)(r=0.68，P<0.

14、05)。 結(jié)論： 1、HIV感染使NK細胞亞群構(gòu)成發(fā)生變化，HIV感染者、AIDS病人CD56dimCD16+NK細胞的百分比下降，CD56-CD16+NK細胞的百分比升高，CD56briCD16+/-NK細胞的百分比顯著升高。 2、HIV感染后，各活化受體和抑制受體在CD56dimCD16+NK細胞表面的表達水平變化：NKG2D+KIR3DL1+的NK細胞水平在HIV組、AIDS組明顯低于正常對照組。NKG2D

15、+NKG2A-的NK細胞水平在HIV組、AIDS組明顯低于正常對照組，AIDS組低于HIV組。NKG2D-NKG2A+的NK細胞水平在HIV組、AIDS組都明顯高于正常對照組，AIDS組顯著高于HIV組。NKG2D+KIR3DL1-的NK細胞水平AIDS組低于正常對照組，AIDS組低于HIV組。NKG2D-KIR3DL1+的NK細胞水平AIDS組明顯高于正常對照組，AIDS組明顯高于HIV組。隨著HIV感染者進入AIDS期，其NK細胞表