1、【背景】
　　獲得性免疫缺陷綜合征（acquiredimmunedeficiencysyndrome，AIDS），簡稱艾滋病，是由人類免疫缺陷病毒（humanimmunodeficiencyvirus，HIV）引起的致命性慢性傳染病。研究顯示CD8+T細(xì)胞在控制HIV-1感染中起重要作用。它所介導(dǎo)的CTLs反應(yīng)是機(jī)體針對HIV-1感染最有力的效應(yīng)武器，但其具體機(jī)制尚未完全闡明。Toll樣受體（Toll-likereceptors，

2、TLRs）作為
　　聯(lián)系固有免疫與適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的橋梁，可特異性的識別病原微生物，偶聯(lián)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，從而誘導(dǎo)特異性基因的表達(dá)和細(xì)胞因子/趨化因子的分泌，在機(jī)體抗感染免疫中發(fā)揮重要作用。已有研究提示TLRs與HIV-1感染密切相關(guān)。但HIV-1感染者CD8+T細(xì)胞與TLRs之間的關(guān)系尚未見報道。因此，本課題主要采用實(shí)時定量PCR（real-timePCR）法、流式細(xì)胞術(shù)及細(xì)胞內(nèi)因子染色（intracellularcytokiness

3、taining,ICS）等技術(shù)分析了31例HIV-1感染者和20例正常人CD8+T細(xì)胞中TLR4、TLR5和TLR7的表達(dá)，以篩選出表達(dá)異常的TLR，并探討其功能，從而為揭示HIV-1感染過程中TLR的作用、確定抗病毒藥物的研制靶點(diǎn)及提供新的疫苗候選分子打下堅實(shí)的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　【目的】
　　1.篩選HIV-1感染者CD8+T細(xì)胞中表達(dá)異常的TLR；2.研究TLR表達(dá)與CD4+T細(xì)胞計數(shù)、HIV-1病毒載量及HAART治療的

4、關(guān)系，探討其在HIV-1感染過程中的意義；3.研究TLR配體對CD8+T細(xì)胞的激活作用及CD8+T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的情況，以了解HIV-1感染過程中TLR的功能及輔助因
　　子在其中的作用。
　　【方法】
　　1.使用富集CD8+T細(xì)胞抗體混合物從人外周血中分離CD8+T細(xì)胞，采用實(shí)時定量PCR法篩選HIV-1感染者CD8+T細(xì)胞中表達(dá)異常的TLRmRNA，TLRmRNA的相對表達(dá)量通過2-△△Ct法計算，隨后采用流式

5、細(xì)胞術(shù)在蛋白水平驗(yàn)證TLR的表達(dá)差異；2.采用流式細(xì)胞術(shù)和實(shí)時熒光定量PCR法檢測HIV-1感染者CD4+T細(xì)胞計數(shù)及病毒載量，通過統(tǒng)計學(xué)方法分析表達(dá)異常的TLR與CD4+T細(xì)胞計數(shù)、病毒載量及HAART治療的關(guān)系；3.采用密度梯度分離法從人外周血中分離PBMC，隨后通過流式細(xì)胞術(shù)檢測不同濃度的TLR7配體（0.5、1和5μg/ml）刺激6h后，純化CD8+T細(xì)胞和PBMC中CD8+T細(xì)胞表面CD69的表達(dá)；4.應(yīng)用細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色技

6、術(shù)檢測不同濃度的TLR7配體（0.5、1和5μg/ml）刺激6h及20h后，純化CD8+T細(xì)胞和PBMC中CD8+T細(xì)胞分泌IL-2和IFN-γ的情況。
　　【結(jié)果】
　　1.實(shí)時定量PCR法檢測HIV-1感染者和正常人CD8+T細(xì)胞中TLR4、TLR5和TLR7的表達(dá)，結(jié)果顯示，HIV-1感染者CD8+T細(xì)胞中均有TLR4、TLR5和TLR7mRNA的表達(dá)，其中HIV-1感染者CD8+T細(xì)胞中TLR7mRNA的表達(dá)顯著升高

7、（P<0.05），而TLR4、TLR5mRNA的表達(dá)未見明顯變化（P>0.05）。為進(jìn)一步證實(shí)TLR7的表達(dá)差異，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測了HIV-1感染者和正常人CD8+T淋巴細(xì)胞中TLR7蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示HIV-1感染者CD8+T細(xì)胞中TLR7蛋白的表達(dá)亦顯著升高（P<0.05）。但HIV-1感染者CD8+T細(xì)胞上TLR7的表達(dá)與CD4+T細(xì)胞計數(shù)、病毒載量均無明顯相關(guān)性（P>0.05）。根據(jù)CD4+T細(xì)胞計數(shù)（>200cells/μ

8、l和<200cells/μl）、病毒載量（>105copies/ml和<105copies/ml）及有無接受HAART治療對HIV-1感染者進(jìn)行分組，TLR7的表達(dá)亦無顯著差異（P>0.05）；
　　2.不同濃度（0.5、1和5μg/ml）的TLR7配體CL097刺激純化CD8+T細(xì)胞和PBMC6h后，用流式細(xì)胞術(shù)檢測CD8+T細(xì)胞表面CD69的表達(dá)水平，結(jié)果顯示HIV-1感染者和正常人純化CD8+T細(xì)胞表面CD69的表達(dá)均增高（

9、P<0.05），并且HIV-1感染者CD8+T細(xì)胞表面CD69的表達(dá)顯著高于其在正常人中的表達(dá)（P<0.05）。此外，HIV-1感染者PBMC中CD8+T細(xì)胞表面CD69的表達(dá)也顯著增高（P<0.05），但與純化的CD8+T細(xì)胞表面CD69的表達(dá)無顯著差異（P>0.05）。并且CD69在CD8+T細(xì)胞表面的表達(dá)呈濃度依賴性，CL097在濃度為0.5μg/ml時，CD8+T細(xì)胞表面CD69的表達(dá)最高；3.不同濃度（0.5、1和5μg/ml

10、）的TLR7配體刺激純化CD8+T細(xì)胞6h后，采用細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色法檢測CD8+T細(xì)胞分泌IL-2和IFN-γ的情況。結(jié)果顯示HIV-1感染者和正常人CD8+T細(xì)胞均未產(chǎn)生IL-2和IFN-γ。延長孵育時間至20小時，仍未見IL-2和IFN-γ的產(chǎn)生。不同濃度的TLR7配體（0.5、1和5μg/ml）刺激HIV-1感染者PBMC6小時后，用細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色法檢測CD8+T細(xì)胞內(nèi)IL-2和IFN-γ的分泌情況，同樣未產(chǎn)生IL-2和IF

11、N-γ。延長孵育時間至20小時，發(fā)現(xiàn)CD8+T細(xì)胞可產(chǎn)生IFN-γ（P<0.05），但未見IL-2的產(chǎn)生。此外，HIV-1感染者PBMC中CD8+T細(xì)胞IFN-γ的產(chǎn)生呈濃度依賴性，CL097在濃度為1μg/ml時，CD8+T細(xì)胞產(chǎn)生的IFN-γ最多。
　　【結(jié)論】
　　1.CD8+T細(xì)胞可表達(dá)TLR4、TLR5和TLR7。但HIV-1感染者CD8+T細(xì)胞中TLR7的表達(dá)顯著升高，提示HIV-1感染的發(fā)生、發(fā)展可能與TLR7

12、有一定關(guān)系；2.TLR7配體可顯著上調(diào)HIV-1感染者CD8+T細(xì)胞表面CD69的表達(dá)，但與PBMC中CD8+T細(xì)胞表面CD69的表達(dá)無顯著差異，提示TLR7信號與HIV-1感染過程中的免疫激活有一定關(guān)系，但不依賴于輔助因子的參與；3.ICS檢測發(fā)現(xiàn)TLR7配體雖不能刺激純化CD8+T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子，但PBMC中的CD8+T細(xì)胞可在其誘導(dǎo)下產(chǎn)生IFN-γ，提示TLR7信號可誘生HIV-1感染者CD8+T細(xì)胞抗病毒分子的產(chǎn)生，但需要輔助