1、前言： 艾滋病(Acquired immunodeficiency syndrome，AIDS)是由人類免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus，HIV)引起的免疫缺陷性疾病，目前尚無治愈手段，疫苗的研究也始終未有突破，根本原因在于對(duì)HIV生物學(xué)和人體免疫應(yīng)答機(jī)制及兩者之間的相互作用關(guān)系等科學(xué)問題缺乏本質(zhì)上的理解和認(rèn)知，特別是對(duì)免疫系統(tǒng)中起關(guān)鍵調(diào)控作用的因子作用仍知之甚少。在免疫系統(tǒng)中，NKT細(xì)胞(

2、natural killer T cell)表達(dá)恒定T細(xì)胞受體(TCR)αβ，可活化T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞，是天然免疫和適應(yīng)性免疫之間的橋梁，為免疫系統(tǒng)中重要的調(diào)控細(xì)胞之一。因此，盡管其數(shù)量較少(人類約占外周血單個(gè)核細(xì)胞的0.01-1％)，但在抗病毒、細(xì)菌、真菌和寄生蟲、抗腫瘤及自身免疫病中均發(fā)揮了重要作用，其在HIV感染中的作用也日益引起重視。國外研究顯示，NKT細(xì)胞高表達(dá)CCR5，占T淋巴細(xì)胞百分率在急性HIV感染期顯著減少，且隨

3、疾病進(jìn)展數(shù)量不斷下降。近期研究顯示，用NKT細(xì)胞特異性抗原α-半乳糖?；拾贝?α-GalCer)做HIV DNA疫苗佐劑可顯著提高HIV特異性T細(xì)胞及中和抗體反應(yīng)。上述研究結(jié)果提示，NKT細(xì)胞在HIV感染疾病進(jìn)程中可能發(fā)揮重要作用。中國人群和歐美人群遺傳背景不同，由其影響的細(xì)胞數(shù)量及表面分子表達(dá)水平可能存在差異，目前尚無HIV感染不同疾病進(jìn)展階段NKT細(xì)胞數(shù)量變化和中國HIV感染者NKT細(xì)胞及其亞型數(shù)量、CCR5表達(dá)水平的報(bào)道。本研究

4、用Vα24+Vβ11+CD3+定義NKT細(xì)胞，研究中國HIV感染者不同疾病進(jìn)展階段NKT細(xì)胞及其亞型數(shù)量、CCR5表達(dá)水平及與HIV感染者疾病進(jìn)程的相關(guān)性，為HIV免疫致病研究提供新的思路。 材料和方法； 1、研究對(duì)象 53例未經(jīng)抗病毒治療的HIV/AIDS患者均來自中國河南，其中男性26例，女性26例，年齡分布為30-68歲(40.7±9.2)，所有患者均經(jīng)Genelab公司蛋白印跡試劑盒確認(rèn)為HIV抗體陽性。

5、根據(jù)HIV感染時(shí)間和CD4+T細(xì)胞數(shù)量將上述患者分為HIV感染緩慢進(jìn)展組(SP組，感染時(shí)間>10年，CD4+T細(xì)胞>500個(gè)/μl)、典型進(jìn)展HIV組(HIV組，CD4+T細(xì)胞介于200-500個(gè)/μl之間，無艾滋病指征性疾病)和典型進(jìn)展AIDS組(AIDS組，CD4+T細(xì)胞<200個(gè)/μl或出現(xiàn)艾滋病指征性疾病)。53例HIV/AIDS患者中SP組12例、HIV組28例、AIDS組13例。健康對(duì)照組為19例隨機(jī)抽取的HIV抗體陰性、未

6、暴露于HIV的健康人，性別、年齡均與HIV/AIDS患者匹配，平均年齡為24-60歲(32.5±12.2)，其中男性10名，女性9名。 2、T細(xì)胞、NK細(xì)胞絕對(duì)值檢測 T絕對(duì)值依據(jù)1997年美國CDC關(guān)于HIV感染者CD4+T細(xì)胞檢測指導(dǎo)方法，應(yīng)用BD公司TruCOUNT管、FACSCalibur流式細(xì)胞儀MULTISET軟件檢測。將20μl CD4FITC/CD8PE/CD3PerCP試劑加入絕對(duì)計(jì)數(shù)管中，經(jīng)反向加樣法

7、加入50μ1抗凝血，室溫避光15min，加入免洗溶血素450μl，室溫避光15min，F(xiàn)ACSMULTISET軟件檢測并進(jìn)行自動(dòng)分析，計(jì)算CD3+T/CD4+T/CD8+T淋巴細(xì)胞絕對(duì)值。 將20μlCD45FITC/CD16+56+PE/CD3PerCP試劑加入絕對(duì)計(jì)數(shù)管中，經(jīng)反向加樣法加入50μl抗凝血，室溫避光15min，加入免洗溶血素450μl，室溫避光15min，F(xiàn)ACS MULTISET軟件檢測并進(jìn)行自動(dòng)分析，計(jì)算N

8、K細(xì)胞絕對(duì)值。 3、NKT細(xì)胞及其亞型絕對(duì)值、表面CCR5表達(dá)水平的檢測 密度梯度離心法分離HIV感染者及健康人PBMC。向流式管中加入2x106PBMC及以下熒光標(biāo)記的單抗進(jìn)行染色：anti-Vα24-FITC、anti-Vβ11-PE、anti-CD3-PerCP、anti-CCR5-APC、anti-CD4-PE-Cy7，混勻后室溫避光30分鐘。用PBS洗滌后加入含1％多聚甲醛的PBS重懸，F(xiàn)ACSAria流式細(xì)胞

9、儀Diva軟件進(jìn)行分析。以FSC、SSC定義淋巴細(xì)胞、CD3-PerCP、Vα24-FITC、Vβ11-PE定義NKT細(xì)胞，計(jì)算NKT細(xì)胞占CD3+T細(xì)胞的百分比、CD4+/CD4-NKT細(xì)胞亞型占總NKT細(xì)胞的百分比及其CCR5的表達(dá)率。NKT細(xì)胞絕對(duì)值由其占CD3+T細(xì)胞的百分比乘以CD3+T細(xì)胞絕對(duì)值獲得。 4、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SAS9.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。不同疾病進(jìn)展階段HIV感染者NKT細(xì)胞及其亞型數(shù)量、C

10、CR5表達(dá)水平等用多個(gè)獨(dú)立樣本兩兩比較的Nemenyi法進(jìn)行比較，NKT細(xì)胞數(shù)量與疾病進(jìn)程相關(guān)性采用Spearman秩相關(guān)檢驗(yàn)，P<0.05視為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 1、HIV/AIDS患者NKT細(xì)胞及其亞型水平 通過檢測外周血中NKT細(xì)胞數(shù)量發(fā)現(xiàn)，HIV/AIDS患者NKT細(xì)胞數(shù)量顯著低于健康對(duì)照組(P<0.05)，AIDS組、HIV組、SP組、健康對(duì)照組NKT細(xì)胞均數(shù)依次上升，其中AIDS組顯著低于健康

11、對(duì)照組(P<0.05)。HIV/AIDS患者CD4+NKT細(xì)胞數(shù)量顯著低于健康對(duì)照組(P<0.05)，其中AIDS組顯著低于SP、HIV組和健康對(duì)照組(P<0.05)，SP、HIV組和健康對(duì)照組之間無顯著差異。HIV/AIDS患者CD4-NKT細(xì)胞數(shù)量顯著低于健康對(duì)照組(P<0.05)，其中AIDS組顯著低于健康對(duì)照組(P<0.05)。不同疾病進(jìn)展階段HIV/AIDS患者NKT細(xì)胞占T淋巴細(xì)胞的百分率，CD4+/CD4-NKT細(xì)胞的比值

12、，隨疾病進(jìn)展有降低趨勢，但無顯著差異。 2、NKT細(xì)胞及其各亞型CCR5的表達(dá)率 HIV組及AIDS組患者CD4+CCR5+NKT細(xì)胞占NKT細(xì)胞百分率顯著低于健康對(duì)照(HIV組：1.23±2.34％；AIDS組：0.61±1.23％；健康對(duì)照：1.64±2.22％)。HIV/AIDS患者CCR5+NKT細(xì)胞中，CD4+NKT細(xì)胞的百分率(32±14％)顯著低于CD4-NKT細(xì)胞(62±25％)(P<0.05)。HIV/

13、AIDS患者NKT細(xì)胞CCR5表達(dá)率為9.57±12.97％，與健康對(duì)照(5.64±5.54％)無顯著差異，CD4+NKT細(xì)胞CCR5表達(dá)率為4.42±7.16％，與健康對(duì)照(3.59±4.41％)無顯著差異(P>0.05)。 3、NKT細(xì)胞及其亞型與疾病進(jìn)展的相關(guān)性 HIV/AIDS患者NKT細(xì)胞與CD4+T細(xì)胞顯著正相關(guān)(r=0.33，P<0.05)，CD4+NKT細(xì)胞與CD4+T細(xì)胞呈顯著正相關(guān)(r=0.51，P<