1、目的：體外研究凋亡抑制基因Bcl-2小干擾RNA（RNAi）轉(zhuǎn)染肺腺癌A549細(xì)胞后對其凋亡的影響，探討B(tài)cl-2小干擾RNA與A549細(xì)胞放射敏感性的關(guān)系，將小干擾RNA技術(shù)與放射治療進(jìn)行有機(jī)結(jié)合，尋求提高腫瘤細(xì)胞放射敏感性的新方法。 方法：1.構(gòu)建Bcl-2基因的干擾質(zhì)粒pBcl-2-siRNA，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染人肺腺癌A549細(xì)胞，同時(shí)設(shè)立轉(zhuǎn)染無意義鏈組、空載體組和未轉(zhuǎn)染組。應(yīng)用Real time RT-PCR和Western b

2、lot的方法觀察Bcl-2基因在mRNA和蛋白水平表達(dá)上的變化，從而鑒定干擾質(zhì)粒pBcl-2-siRNA的有效性。2.流式細(xì)胞術(shù)檢測A549細(xì)胞凋亡率，量化凋亡結(jié)果，比較干擾質(zhì)粒pBcl-2-siRNA組、無意義鏈組、空載體組和未轉(zhuǎn)染組凋亡率的不同。并給予6Gy X線照射，再次比較以上四組細(xì)胞凋亡率的變化。3.克隆形成實(shí)驗(yàn)獲得干擾質(zhì)粒pBcl-2-siRNA組、無意義鏈組、空載體組和未轉(zhuǎn)染組在各劑量下的細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)，利用統(tǒng)計(jì)軟件完成細(xì)胞

3、放射后存活曲線的擬和，證明干擾質(zhì)粒pBcl-2-siRNA對A549細(xì)胞放射敏感性的增強(qiáng)效應(yīng)。 結(jié)果：1.成功構(gòu)建了Bcl-2 SiRNA質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞后，經(jīng)篩選獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株A549/Bcl2-Ins，Real time RT-PCR顯示Bcl-2 mRNA表達(dá)明顯降低，Western blot表明Bcl-2蛋白表達(dá)明顯降低。證明A549細(xì)胞的Bcl-2基因在mRNA和蛋白水平被成功抑制。2.流式細(xì)胞術(shù)檢測A549

4、/Bcl2-Ins凋亡率[（10.11±0.92）％]明顯高于對照組[（5.52±0.48）％]等，6Gy X線照射后凋亡率[（28.81±1.10）％]明顯高于對照組[（19.88±0.88）％]等，及未照射組[（5.52±0.48）％]等。證明Bcl-2 SiRNA質(zhì)粒增加了A549細(xì)胞的凋亡，并與放射線有協(xié)同作用。3.克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)A549/Bcl2-Ins的D0和Dq值分別為1.399和1.298，明顯低于轉(zhuǎn)染無意義序列的

5、細(xì)胞株A549/ Bcl2-Neg（1.695和2.480）、轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞株A549/SD（1.706和2.227）和空白對照細(xì)胞A549（1.816和2.777）。A549/Bcl2-Ins較其他對照組放射增敏有顯著差異（P<0.05）。 結(jié)論：1.本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建的Bcl-2 SiRNA質(zhì)粒，能有效地抑制相應(yīng)基因的表達(dá)。2.向A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染Bcl-2 SiRNA質(zhì)粒能夠顯著增加細(xì)胞凋亡，并與放射線有協(xié)同作用。3.轉(zhuǎn)染后A