1、研究背景：
　　 放射治療是現(xiàn)代腫瘤治療的主要手段之一,但大多數(shù)惡性腫瘤存在不同程度的放射抗拒性,嚴(yán)重影響了放射治療的療效?？朔@種放射抵抗性對(duì)改善腫瘤放射治療效果具有重要臨床意義。腫瘤細(xì)胞對(duì)放射線的敏感性主要取決于修復(fù)DNA損傷的能力。腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞之間存在DNA修復(fù)機(jī)制的差異也提示DNA損傷修復(fù)蛋白是腫瘤放射增敏治療的優(yōu)秀靶點(diǎn)。從分子機(jī)制上來說,電離輻射(IR)對(duì)細(xì)胞的主要致死性損傷為DNA雙鏈斷裂(DSBs)。DSBs

2、不能修復(fù)或錯(cuò)誤修復(fù)會(huì)導(dǎo)致染色體缺失、變異最終發(fā)生細(xì)胞死亡。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞,DSBs主要通過非同源末端連接(NHEJ)途徑進(jìn)行修復(fù),并且伴隨著由ATM啟動(dòng)的多種信號(hào)通路反應(yīng),調(diào)節(jié)細(xì)胞周期阻滯等,以便協(xié)助修復(fù)。NHEJ途徑至少涉及7個(gè)主要成員的協(xié)同作用,DNA-PKcs,KLJ70／KLJ80,Artemis,XRCC4,DNA連接酶Ⅳ,XLF。、NHEJ蛋白的任一成員的缺陷或失活均表現(xiàn)為DSBs修復(fù)缺陷而引起的對(duì)IR敏感性的增加。抑制NH

3、EJ修復(fù)途徑和ATM依賴的修復(fù)反應(yīng)來增加腫瘤細(xì)胞的放射敏感性已有研究但仍很滯后,需做不斷的研究和革新。Artemis是目前研究最熱門的NHEJ修復(fù)分子。它的突變或缺陷會(huì)導(dǎo)致人類放射敏感性嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷(RS-SCID)綜合癥,表現(xiàn)為V(D)J重組障礙而致免疫功能缺陷,以及對(duì)離子射線嚴(yán)重的敏感性。研究表明,IR誘導(dǎo)的DSBs損傷修復(fù)中,Artemis受DNA-PKcs的調(diào)節(jié)參與復(fù)雜染色體斷端的處理,受ATM的調(diào)節(jié)參與染色質(zhì)重構(gòu)和端粒維持

4、,細(xì)胞周期檢查點(diǎn)調(diào)控等方面的細(xì)胞修復(fù)反應(yīng)。因此,Artemis在IR誘導(dǎo)的DSBs的修復(fù)反應(yīng)中,不僅是效應(yīng)器也是信號(hào)傳遞分子,其在整合DNA損傷信號(hào)通路,細(xì)胞反應(yīng)和DNA修復(fù)方面具有獨(dú)特的關(guān)鍵性作用。Artemis在DSBs修復(fù)中的重要作用解釋了Artemis缺陷細(xì)胞對(duì)IR的高敏感性,同時(shí)也提示Artemis可以作為放射增敏的新靶點(diǎn)。然而,目前對(duì)于抑制Artemis在增加腫瘤細(xì)胞放射敏感性方面所起的作用及相關(guān)機(jī)制尚無開展,在本研究中,我

5、們對(duì)此進(jìn)行了探索,并且提出了Artemis作為腫瘤放射增敏治療靶點(diǎn)的潛在價(jià)值和臨床意義。
　　 實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果：
　　 1、Artemis在人類結(jié)直腸癌中的表達(dá)及與其放射敏感性的相關(guān)性研究。
　　 研究Artemis在腫瘤內(nèi)的表達(dá)情況及與放射敏感性之間的相關(guān)性對(duì)于建立以Artemis為靶點(diǎn)的放射增敏的策略是非常必要的。我們以50例臨床獲取的人類結(jié)直腸癌組織及癌旁正常組織樣本為研究對(duì)象,通過定量PCR的方法,評(píng)估了

6、Artemis在癌及癌旁組織中的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)了28％的結(jié)腸癌組織中Artemis是高表達(dá)的,然后又在多個(gè)腸癌細(xì)胞系,使用定量PCR及克隆生存實(shí)驗(yàn)等評(píng)估了Artemis表達(dá)水平及其對(duì)放射線的敏感性,發(fā)現(xiàn)了二者之間存在的相關(guān)性,建立了Artemis作為放射增敏靶點(diǎn)的必要性及潛在價(jià)值。
　　 2、慢病毒介導(dǎo)的RNAi技術(shù)靶向抑制Artemis表達(dá)增強(qiáng)腸癌細(xì)胞的放射敏感性及相關(guān)機(jī)制研究
　　 Artemis亞等位基因造成的Ar

7、temis的顯著低水平表達(dá)的細(xì)胞表現(xiàn)出類似于Artemis缺陷細(xì)胞的高放射敏感性,這也提示靶向沉默Artemis可能可以增加對(duì)放射線的敏感性。因此,我們篩選了可以有效沉默Artemis的siRNA靶點(diǎn),并構(gòu)建入慢病毒載體,借此沉默了人結(jié)直腸癌細(xì)胞系RKO細(xì)胞的Artemis蛋白,然后通過克隆生存實(shí)驗(yàn)及MTT實(shí)驗(yàn)并結(jié)合裸鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了沉默Artemis的RKO細(xì)胞對(duì)IR以及其他DNA損傷劑的敏感性明顯的增加。使用γ H2AX焦點(diǎn)分析法檢

8、測了Artemis沉默RKO細(xì)胞的DSBs修復(fù)動(dòng)力學(xué)的改變,證明了其DNA損傷修復(fù)的損害發(fā)生在8小時(shí)之后的慢修復(fù)通路,表現(xiàn)了與Artemis缺陷細(xì)胞相似的表型。最后通過各種凋亡檢測方法及免疫印跡的方法證明沉默Artemis對(duì)RKO細(xì)胞在DNA損傷劑誘導(dǎo)下發(fā)生了更多的凋亡事件,其中涉及了p53／p21通路相關(guān)的凋亡信號(hào)通路。
　　 3、 Anemis顯性失活突變體對(duì)腫瘤細(xì)胞的放射增敏作用及相關(guān)機(jī)制的研究。
　　 失活基因的

9、方法除了siRNA干擾以外,還有一種引入顯性失活突變體的方法。顯性失活突變的方法比siRNA更加特異,適用范圍更廣泛。Artemis的一些突變體形式具有顯性失活作用已有報(bào)道?；趯?duì)Artemis蛋白結(jié)構(gòu)和功能調(diào)節(jié)的深刻理解的基礎(chǔ)之上,在本研究中,我們通過基因克隆的方法構(gòu)建了C末端缺失且無核酶活性的Artemis突變體并將其過表達(dá)在放射抗拒腫瘤細(xì)胞系HeLa中,使用克隆生存分析法及MTT法,證明了Artemis突變體可以增加腫瘤細(xì)胞對(duì)DN

10、A損傷劑的敏感性,并使用γ H2AX焦點(diǎn)分析證明其對(duì)DNA修復(fù)的影響是類似于Artemis缺陷細(xì)胞的,最后通過免疫共沉淀及磷酸化分析證明了Artemis突變體具有競爭結(jié)合Artemis上游蛋白DNA-PKcs和ATM的能力而損害了內(nèi)源性Artemis的磷酸化過程,因而可能損害了Artemis相關(guān)的細(xì)胞DNA損傷修復(fù)反應(yīng)。
　　 結(jié)論：
　　 1、首次研究了Artemis在腫瘤組織內(nèi)的表達(dá)情況,證明了Artemis表達(dá)在不

11、同的組織間存在明顯的異質(zhì)性,部分結(jié)直腸癌腫瘤組織內(nèi)Artemis的表達(dá)高于癌旁正常組織,而且腫瘤細(xì)胞內(nèi)高水平的Artemis表達(dá)與其放射抗拒存在一定的相關(guān)性,我們提出在Artemis高表達(dá)且放射線抗拒的結(jié)直腸癌,靶向抑制Artemis增強(qiáng)腫瘤對(duì)放射線的敏感性且利于降低周圍組織損傷的治療策略有重要臨床意義。
　　 2、構(gòu)建了具有高干擾效率Artemis慢病毒RNAi載體,在目的細(xì)胞沉默了Artemis蛋白,然后在體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)均證明

12、了靶向沉默Artemis蛋白可以增加腫瘤細(xì)胞對(duì)IR及DNA損傷劑CPT等的敏感性,其中涉及p53／p21相關(guān)凋亡通路的參與。這是國際上首次通過靶向抑制Artemis表達(dá)而調(diào)節(jié)了腫瘤放射敏感性的研究,它為臨床上治療放療抵抗或化療抵抗的結(jié)直腸癌提供改善治療效果的新策略。
　　 3、構(gòu)建了人Artemis蛋白的突變體質(zhì)粒載體,證明了過表達(dá)突變體Artemis可以增加腫瘤細(xì)胞對(duì)IR及DNA損傷劑Etoposide的敏感性,用顯性失活的方