1、目的： 原發(fā)性肝癌在我國較常見，占全部惡性腫瘤死亡的18.8％，居第二位。肝癌傳統(tǒng)的治療手段有手術(shù)、放射治療、介入化療等。手術(shù)是治療原發(fā)性肝癌最主要的手段，大多數(shù)患者常常因病期晚、肝功能差、病變部位特殊等而喪失手術(shù)機(jī)會。手術(shù)能切除的病例只占全部病例的5％～10％，因此尋找更為有效的治療手段就非常重要。作為肝癌手術(shù)的輔助手段一放化療，雖然近年取得很大的進(jìn)步，但療效仍有限，關(guān)鍵是放化療可能誘導(dǎo)了腫瘤細(xì)胞中的凋亡抑制基因的表達(dá)而導(dǎo)致腫

2、瘤細(xì)胞對放化療的抗拒。因此尋求通過基因干擾的手段增加治療療效的手段就顯得十分重要。 目前認(rèn)為腫瘤的發(fā)生是由于控制正常細(xì)胞增殖、分化和凋亡的多個基因突變的結(jié)果。其中ras基因突變引起的關(guān)注較高，原癌基因ras是一種多功能的細(xì)胞因子，是人類腫瘤中最常被激活的癌基因，其結(jié)構(gòu)與功能在進(jìn)化上具有高度的保守性，廣泛存在于自然界，在多種細(xì)胞生命活動中起極為重要的作用，包括細(xì)胞的增殖、分化和細(xì)胞骨架的構(gòu)建。也是人們最先證實與腫瘤發(fā)生有關(guān)的基因之

3、一。Ras基因家族有3個成員，在人類部分腫瘤中，只要3個Ras基因中有一個基因發(fā)生點突變就會引起突變位點上的基因發(fā)生改變，這些位點的突變使Ras基因激活，導(dǎo)致P21蛋白的過度生成，持續(xù)不斷地將信號傳入細(xì)胞，造成細(xì)胞的轉(zhuǎn)化或惡變。1988年顧建人等首次從一例原發(fā)性肝癌的基因文庫中直接克隆了一株具有很高轉(zhuǎn)化活性的N-ras全基因，進(jìn)一步說明了N-ras與肝癌的關(guān)系。在多種生物細(xì)胞中，外源或內(nèi)源性雙鏈：RNA可觸發(fā)同源mRNA的特異性降解，從

4、而使該基因表達(dá)沉默，這種現(xiàn)象稱為RNA干擾。因RNA干擾導(dǎo)致的基因沉默發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平，也稱為轉(zhuǎn)錄后基因沉默。RNAi技術(shù)具有嚴(yán)格的序列特異性、高效性，基因抑制效果明確、治療的針對性強(qiáng)、副作用小等優(yōu)勢，已日益發(fā)展成為研究基因功能和腫瘤基因治療的重要工具。相對siRNA來說，單克隆抗體、反義寡核苷酸及其它Ras小分子抑制劑更易產(chǎn)生非特異性副作用，而siRNA誘導(dǎo)的基因沉默顯示了顯著的特異性，并且能夠短時間內(nèi)沉默目的基因。目前siRNA已經(jīng)

5、被成功應(yīng)用在植物和動物細(xì)胞中沉默許多基因，而且靶向基因產(chǎn)物表達(dá)的降低非常顯著，并且RNAi的作用能夠遺傳給子代細(xì)胞。也因此美國斯坦福大學(xué)醫(yī)學(xué)院的Andrew z.Fire和馬薩諸塞大學(xué)癌癥中心Craig C.MeUo發(fā)現(xiàn)RNA干擾(RNAi)而獲2006年度諾貝爾生理學(xué)/醫(yī)學(xué)獎。 方法 常規(guī)腫瘤細(xì)胞復(fù)蘇、培養(yǎng)后，細(xì)胞爬片采用免疫組化的方法明確選擇的肝癌細(xì)胞株HepG2和MHCC97-H具有N-Ras基因的突變。根據(jù)gen

6、e-bank提供的N-Ras序列設(shè)計干擾小RNA片斷，siRNA轉(zhuǎn)染后在熒光顯微鏡下確定帶有熒光標(biāo)記的序列是否轉(zhuǎn)染進(jìn)入肝癌細(xì)胞株，通過免疫組化觀察RNAi后N-Ras蛋白表達(dá)情況的變化，通過western blot和RT-PCR以N-Ras基因與GAPDH基因的吸光度比值表示N-Ras mRNA和N-Ras蛋白表達(dá)量，計算RNAi N-Ras基因表達(dá)的抑制效率。通過MTT法酶聯(lián)免疫檢測儀570nm處測定各孔吸光度值(A值)檢測細(xì)胞生長曲

7、線的變化和腫瘤細(xì)胞生長的抑制率。運用流式細(xì)胞儀檢測RNAi后肝癌細(xì)胞株的細(xì)胞周期變化和細(xì)胞凋亡情況。最后通過對照研究RNAi前后兩株肝癌細(xì)胞不同劑量照射后腫瘤細(xì)胞集落形成率，利用Graphpad prism 4.0軟件擬和線性二次曲線模型和單擊多靶模型，得到放射生物學(xué)參數(shù)，明確RNAi N-Ras基因是否具有增加放射敏感性的變化。 結(jié)果 1人肝癌細(xì)胞株HepG2和MHCC97-H免疫組化顯示Ras蛋白表達(dá)呈強(qiáng)陽性，說明選擇

8、的肝癌細(xì)胞株具有Ras基因突變。 2 轉(zhuǎn)染效率，按發(fā)綠色熒光細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分率計算，MHCC97-H細(xì)胞平均轉(zhuǎn)染效率為91％，hepG2細(xì)胞的平均轉(zhuǎn)染效率為93％。 3 RT-PCR HepG2細(xì)胞和MHCC97-H細(xì)胞RNAi后的PCR產(chǎn)物電泳帶密度較干擾前明顯減弱，HepG2細(xì)胞RNAi后N-Ras mRNA表達(dá)抑制率為61.3+3.351％，空白質(zhì)粒組為1.93+0.346％，有顯著性差異；MHCC97-H細(xì)

9、胞RNAi后N-Ras mRNA表達(dá)抑制率為96.9±0.159％，空白質(zhì)粒組為4.6±0.2.81 1％，有顯著性差異。 4 western blot HepG2細(xì)胞和MHCC97-H細(xì)胞RNAi后N-Ras蛋白電泳密度明顯減低，Ras蛋白的表達(dá)抑制率63.7±0.041％，空白質(zhì)粒組為2.2±0.007％。有顯著性差異；MHCC97-HRNAi后N-Ras蛋白的表達(dá)抑制率89.8±0.012％，空白質(zhì)粒組為2.3±0.005

10、％。有顯著性差異。 5 HepG2細(xì)胞RNAi后免疫組化檢測仍有40％左右N-Ras蛋白表達(dá)。MHCC97-H細(xì)胞RNAi后免疫組化檢測未見N-Ras表達(dá)。 6 MTT所測的MHCC97-H細(xì)胞干擾前后生長曲線顯示RNAi后細(xì)胞增殖速度減慢，細(xì)胞生長受到抑制，與未RNAi細(xì)胞之間從第1天開始差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，此后差別越來越顯著。MTT所測的HepG2細(xì)胞干擾前后生長曲線顯示實驗組細(xì)胞增殖速度減慢，細(xì)胞生長

11、受到抑制，與對照組之間從第3天開始差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，此后差別越來越顯著。 7 MHCC97-H細(xì)胞和HepG2細(xì)胞生長RNAi后生長抑制率分別為：21.9％，23.8％。 8 流式細(xì)胞儀檢測MHCC97-H細(xì)胞和HepG2細(xì)胞RNAi后出現(xiàn)G1阻滯，有統(tǒng)計學(xué)差異，凋亡RNAi前增多。 9 MHCC97-H細(xì)胞和HepG2細(xì)胞生長RNAi后不同劑量照射后，MHCC97-H細(xì)胞干擾前后D0值分別為：3

12、.00±0.077，3.34±0.015：HepG2細(xì)胞干擾前后分別為：2.38±0.05，2.33±0.10。MHCC97-H細(xì)胞干擾前后Dq值分別為：2.89±0.042，1.83±0.22:HepG2細(xì)胞干擾前后分別為：2.88±0.087，2.28±0.01 8。D<,q>值均較前減小，且有顯著性差異。MHCC97-H細(xì)胞干擾前后SF<,2>值分別為：0.817+0.01，0.716±013：H印G2細(xì)胞干擾前后分別為：0.82

13、4±0.001，0.742±0.020。兩株肝癌細(xì)胞RNAi前后SF<,2>具有顯著性差異。MHCC97-H細(xì)胞RNA干擾前后增敏比SER=1.15，HepG2細(xì)胞RNA干擾前后增敏比SER=1.10。MHCC97-H細(xì)胞干擾前后α/β值分別為：4.21±1.536，9.837±2.234：HepG2細(xì)胞干擾前后分別為：0.938+0.132，2.98±1.232。HepG2細(xì)胞RNAi后的α/β值較前有顯著性差異。 結(jié)論：

14、 1.原發(fā)性肝癌的發(fā)生、發(fā)展中癌基因N.Ras基因突變具有十分重要的作用。 2.本研究所構(gòu)建的N-Ras基因的siRNA可以有效、特異地阻斷N-Ras基因的表達(dá)，阻斷N-Ras基因可以改變細(xì)胞周期的分布G1阻滯，誘導(dǎo)凋亡增加。不同狀態(tài)P53基因的肝癌細(xì)胞生長速度明顯減慢。 3.本研究首次運用RNAi技術(shù)研究兩株不同狀態(tài)的p53基因的肝癌細(xì)胞株的放射敏感性，研究表明RNAi N-Ras基因可以改變肝癌細(xì)胞株的各個放射生