1、鼻咽癌是我國高發(fā)腫瘤，國內(nèi)外研究證明EB病毒(Epstein-Barrvirus，EBV)編碼的潛伏膜蛋白1(latent membrane protein1，LMP1)在其發(fā)生發(fā)展中起重要作用，被認(rèn)為是鼻咽癌的致癌基因。RNA干擾(RNA interference，RNAi)和脫氧核酶(deoxyribozyme，DNAzyme，DZ)技術(shù)是能夠有效抑制目的基因表達(dá)的兩種基因治療策略，已被廣泛應(yīng)用于目的基因功能研究和腫瘤及病毒的基因治

2、療中。 本研究針對EBV-LMP1 mRNA設(shè)計、構(gòu)建表達(dá)小發(fā)卡狀RNA(short hairpin RNA，shRNA)的重組表達(dá)載體(pshRNA-LMP1)，觀察pshRNA-LMP1在鼻咽癌細(xì)胞內(nèi)抑制EBV-LMP1基因表達(dá)的效率及對鼻咽癌細(xì)胞產(chǎn)生的生物學(xué)影響，以及聯(lián)合脫氧核酶抑制EBV-LMP1基因表達(dá)的效應(yīng)，為鼻咽癌的預(yù)防和臨床治療提供新的基因治療策略。 第一部分小發(fā)卡狀RNA抑制綠色熒光蛋白在鼻咽癌細(xì)胞中表

3、達(dá)的可行性研究 目的：設(shè)計構(gòu)建針對綠色熒光蛋白(GFP)小發(fā)卡狀RNA表達(dá)載體，觀察其在鼻咽癌細(xì)胞中對綠色熒光蛋白表達(dá)的抑制作用，證實shRNA表達(dá)載體誘導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)在鼻咽癌細(xì)胞株中沉默目標(biāo)基因表達(dá)的可行性。 方法：增強(qiáng)型綠色熒光蛋白質(zhì)粒(pEGFP-N1)轉(zhuǎn)染鼻咽癌HNE1細(xì)胞并予G418篩選穩(wěn)定表達(dá)GFP的細(xì)胞克隆(HNE1-GFP)；設(shè)計構(gòu)建針對GFP的小發(fā)卡狀RNA表達(dá)載體(pshRNA-GFP)；觀察不同

4、濃度pshRNA-GFP抑制HNE1-GFP靶基因mRNA、蛋白表達(dá)情況及細(xì)胞毒性大小。 結(jié)果：pshRNA-GFP能夠顯著抑制鼻咽癌細(xì)胞中GFP基因mRNA和蛋白水平的表達(dá)且無細(xì)胞毒性；pshRNA-GFP1:3和2:5濃度級別組有較高的抑制效率。 結(jié)論：特異性小發(fā)卡狀RNA能夠有效抑制鼻咽癌細(xì)胞內(nèi)源性GFP的表達(dá)，表明shRNA表達(dá)載體介導(dǎo)的RNA干擾在鼻咽癌細(xì)胞株中抑制目標(biāo)基因表達(dá)具有可行性。 第二部分 E

5、BV-LMP1熒光融合真核表達(dá)載體的構(gòu)建及熒光可視化篩選細(xì)胞平臺的建立 目的：構(gòu)建EBV-LMP1綠色熒光融合蛋白真核表達(dá)載體，觀察綠色熒光融合蛋白在鼻咽癌細(xì)胞的表達(dá)情況，為利用該熒光可視化細(xì)胞系統(tǒng)篩選高效特異的pshRNA-LMP1建立細(xì)胞平臺。 方法：從B95-8細(xì)胞中提取總RNA，通過RT-PCR擴(kuò)增EBV-LMP1cDNA片段，構(gòu)建重組T載體pMD18-T-LMP1m。以重組T載體為模板，構(gòu)建LMP1綠色熒光融合

6、蛋白真核表達(dá)載體pEGFP-N1-LMP1m、pEGFP-C1-LMP1m、pEGFP-N1-LMP1a、pEGFP-C1-LMP1c。在鼻咽癌HNE1細(xì)胞中觀察融合蛋白熒光表達(dá)情況，RT-PCR及westem blot鑒定融合蛋白在HNE1細(xì)胞中的表達(dá)。 結(jié)果：成功構(gòu)建pEGFP-N1-LMP1m、pEGFP-C1-LMP1m、pEGFP-N1-LMP1a、pEGFP-C1-LMP1c真核表達(dá)重組載體，轉(zhuǎn)染HNE1細(xì)胞后可見熒

7、光融合蛋白的表達(dá)，RT-PCR和westem blot證實LMP1融合蛋白表達(dá)成功。 結(jié)論：在鼻咽癌HNE1細(xì)胞中實現(xiàn)了LMP1蛋白的N端、C端及全長蛋白表達(dá)，成功建立了EBV-LMP1相關(guān)熒光可視化細(xì)胞平臺，為進(jìn)一步進(jìn)行EBV-LMP1靶向小干擾RNA的熒光可視化篩選奠定了基石出。 第三部分靶向小發(fā)卡狀RNA在鼻咽癌細(xì)胞中的熒光可視化篩選和其效應(yīng)觀察 目的：構(gòu)建并篩選高效特異抑制鼻咽癌細(xì)胞內(nèi)EBV-LMP1基因

8、表達(dá)的靶向小發(fā)卡狀RNA表達(dá)載體(pshRNA-LMP1)，并觀察其在鼻咽癌細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)。 方法：設(shè)計構(gòu)建5個pshRNA-LMP1。優(yōu)化重組質(zhì)粒pEGFP-N1-LMP1m和pshRNA-LMP1共轉(zhuǎn)染HNE1細(xì)胞的條件。觀察pshRNA-LMP1抑制熒光融合蛋白表達(dá)的高效性和特異性，RT-PCR及Westem Blot檢測LMP1mRNA和蛋白表達(dá)，MTT檢測細(xì)胞增值活力、AO/EB檢測細(xì)胞凋亡、流式檢測熒光抑制率

9、。 結(jié)果：成功構(gòu)建5個LMP1靶向小發(fā)卡狀RNA表達(dá)載體：pshRNA-LMP1-130/318/3521/3519/3519c。pEGFP-N1-LMP1m 與pshRNA-LMP1共轉(zhuǎn)染HNE1細(xì)胞的最佳比例為0.5μg：1.0μg。篩選出pshRNA-LMP1-3519具有最佳特異性和高效性且無細(xì)胞毒性，能有效降低LMP1mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平，并能抑制HNE1細(xì)胞的生長及促進(jìn)細(xì)胞凋亡。 結(jié)論：利用熒光可視化的細(xì)

10、胞平臺，構(gòu)建并篩選出高效特異的EBV-LMP1靶向shRNA表達(dá)載體pshRNA-LMP1-3519，證實了其在鼻咽癌細(xì)胞中的對靶基因沉默作用，及其促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞的凋亡和抑制鼻咽癌細(xì)胞的生長的作用。為進(jìn)一步應(yīng)用RNA干擾技術(shù)抑制鼻咽癌增殖生長等動物實驗提供了實驗基礎(chǔ)。 第四部分靶向小發(fā)卡狀RNA聯(lián)合脫氧核酶在鼻咽癌細(xì)胞中抑制EBV-LMP1基因表達(dá)的研究 目的：觀察小發(fā)卡狀RNA聯(lián)合脫氧核酶抑制鼻咽癌細(xì)胞中EBV-LMP

11、1基因表達(dá)的協(xié)同作用，為進(jìn)一步進(jìn)行動物及臨床試驗提供實驗依據(jù)。 方法：pshRNA-LMP1-3519聯(lián)合前期實驗證實能在鼻咽癌細(xì)胞中有效抑制EBV-LMP1表達(dá)的脫氧核酶DZ167和DZ509，與重組載體pEGFP-N1-LMP1m共轉(zhuǎn)染HNE1細(xì)胞，流式檢測熒光抑制率、RT-PCR和Westem Blot分別檢測EBV-LMP1基因mRNA和蛋白表達(dá)。 結(jié)果：熒光表達(dá)抑制率分別為pshRNA-LMP1-3519單獨干

12、擾組75.15％；pshRNA-LMP1-3519聯(lián)合DZ167干預(yù)組86.31％；pshRNA-LMP1-3519聯(lián)合DZ509干預(yù)組88.88％，流式檢測綠色熒光表達(dá)率pshRNA-LMP1-3519單獨干擾組12.99％，聯(lián)合干預(yù)組5.60％；RT-PCR和Westem Blot均證實pshRNA-LMP1-3519聯(lián)合DZ167/509干預(yù)組能更有效降低EBV-LMP1基因mRNA和蛋白表達(dá)。 結(jié)論：小發(fā)卡狀RNA聯(lián)合脫