1、前言：
　　 日光紫外線(ultra violetradiation,UV)照射可引起急性損傷如日曬傷和慢性累積性損傷如皮膚癌及光老化。日光中紫外線誘導(dǎo)的DNA損傷是導(dǎo)致皮膚癌發(fā)生的一個(gè)重要因素,同時(shí)在皮膚癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn),調(diào)控細(xì)胞增殖、分化和凋亡的特異性基因出現(xiàn)與紫外線損傷相關(guān)的變異。根據(jù)日光中紫外線波長(zhǎng)的不同,可將其分為3種:UVA,UVB和UVC,造成生物損害的紫外線主要是波長(zhǎng)短,能量較高的UVB(波長(zhǎng)290-320nm),是

2、導(dǎo)致DNA損傷的主要類型。目前已證實(shí)一些原癌基因和抑癌基因由于紫外線引起的DNA損傷而發(fā)生變異。UV誘導(dǎo)產(chǎn)生皮膚癌是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程,涉及到許多細(xì)胞和分子水平上的變化,同時(shí)還與DNA的修復(fù)作用相關(guān)。
　　 腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程,事實(shí)上,惡性增生多數(shù)是由多種因素和多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路失調(diào)促成的。磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMPK)是體內(nèi)的能量調(diào)節(jié)器,AMPK激活后可促進(jìn)葡萄糖重吸收、糖酵解和脂肪酸氧化,減少脂肪酸、膽固

3、醇和蛋白質(zhì)的合成,儲(chǔ)存能量,被稱為“細(xì)胞能量調(diào)節(jié)器”,近年來(lái)關(guān)于該通路在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中的作用研究很多,發(fā)現(xiàn)其在多種腫瘤中表達(dá)缺失。AICAR和metformin是目前研究最多的AMPK通路激活劑,本文通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)及構(gòu)建SKH-1無(wú)毛小鼠紫外線致皮膚癌模型研究該藥物對(duì)紫外線輻射誘導(dǎo)皮膚癌的預(yù)防和治療作用,并闡明其機(jī)制。
　　 目的：
　　 本實(shí)驗(yàn)擬觀察AICAR和metformin處理的正常人上皮角化細(xì)胞(norma

4、lhumanepidermalkeratinocytes,NHEK)及AMPKwide-type(WT)和AMPKknockdown(KD)鼠胚胎成纖維細(xì)胞(mouseembryonicfibroblast,MEF),經(jīng)過(guò)紫外線(主要是UVB)輻射后AMPK通路相關(guān)分子改變,及DNA損傷修復(fù)改變,并通過(guò)構(gòu)建紫外線致SKH-1無(wú)毛小鼠皮膚癌模型研究這兩種藥物對(duì)紫外線輻射誘導(dǎo)皮膚癌的預(yù)防和治療作用,并探討其作用機(jī)制。
　　 材料與方

5、法：
　　 1、常規(guī)培養(yǎng)的MEF細(xì)胞WT和KO,加或不加AICAR及metformin處理24,48,72h后,MTS方法檢測(cè)細(xì)胞存活曲線。
　　 2、常規(guī)培養(yǎng)的MEF細(xì)胞,WT和KD,照射UVB(10焦耳),后0,6,24,48h提取DNA;常規(guī)培養(yǎng)的MEF細(xì)胞WT和KD分別加或不加AICAR及metformin培養(yǎng)24h后,照射UVB(10焦耳),后0,6,24h提取DNA;SKH-1無(wú)毛小鼠,UVB照射前1h,后背

6、涂或不涂丙酮配置的AICAR和metformin溶液,進(jìn)行單次UVB照射后處死小鼠,剝離皮膚提取DNA;SlotBlot方法檢測(cè)UVB照射后不同時(shí)間DNA片段CPD及6-4PP修復(fù)情況。
　　 3、動(dòng)物實(shí)驗(yàn):動(dòng)物培養(yǎng)遵守芝加哥大學(xué)動(dòng)物保護(hù)和使用機(jī)構(gòu)條例,分為2部分,第一部分,預(yù)防輻射致皮膚癌模型:SKH-1無(wú)毛小鼠,分為4組,對(duì)照組,單純照射組,AICAR(1umol)處理組,Metformin(2umol)處理組,每周UVB照

7、射(100mJ/cm2)三次,連續(xù)25周,實(shí)驗(yàn)組小鼠每次照射前后背照射區(qū)域皮膚涂AICAR或metformin。每周記錄小鼠體重變化及皮膚變化,記錄腫瘤發(fā)生時(shí)間,及腫瘤數(shù)目。第二部分,輻射致皮膚癌治療模型:SKH-1無(wú)毛小鼠,每周UVB照射(100mJ/cm2)三次,至17周,按照生成腫瘤大小及數(shù)目隨機(jī)分為單純照射組,metformin涂藥治療組,metformin灌胃治療組,繼續(xù)照射,每日照射前進(jìn)行相應(yīng)處理。繼續(xù)每周記錄腫瘤數(shù)目,大小

8、變化。
　　 4、提取細(xì)胞蛋白,小鼠后背皮膚蛋白,采用Westernblot法檢測(cè)ERK通路相關(guān)分子變化及DNA修復(fù)相關(guān)蛋白變化。
　　 5、HE染色觀察照射后各組小鼠皮膚上皮增生增厚情況。
　　 6、免疫組化方法檢測(cè)照射后小鼠正常皮膚及腫瘤組織增殖因子Ki67表達(dá)情況。
　　 7、采用Prism5(GraphPadsoftware,SanDiego,CA)統(tǒng)計(jì)軟件分析,所有數(shù)據(jù)用3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的均值±標(biāo)準(zhǔn)

9、誤表示,采用t檢驗(yàn)及方差分析,P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1、為了證實(shí)AMPK信號(hào)通路在皮膚癌發(fā)生發(fā)展中的作用,我們用WesternBlot檢測(cè)了P-AMPK,P-ACC,ACC在正常人皮膚上皮細(xì)胞,人皮膚癌細(xì)胞,紫外線誘導(dǎo)小鼠皮膚癌細(xì)胞,及紫外線照射后0.5,6,24h正常小鼠皮膚、未照射小鼠皮膚中的表達(dá),我們發(fā)現(xiàn)AMPK信號(hào)通路在皮膚腫瘤中被抑制,紫外線照射短時(shí)間內(nèi)0.5和6h時(shí)被激活,24h后

10、被抑制。
　　 2、激活A(yù)MPK通路抑制紫外線誘導(dǎo)的小鼠皮膚腫瘤形成。我們用AMPK信號(hào)通路激活劑AICAR及metformin處理SKH-1無(wú)毛小鼠,westernBlot結(jié)果顯示P-ACC表達(dá)增加,AICAR和metformin激活小鼠皮膚AMPK通路;應(yīng)用AICAR及metformin的紫外線照射組與單純紫外線照射相比,用藥組延遲紫外線誘導(dǎo)小鼠皮膚癌發(fā)生時(shí)間,減少腫瘤生成個(gè)數(shù)及大小。
　　 3、AICAR和metf

11、ormin通過(guò)AMPK通路增加UVB導(dǎo)致的DNA損傷后修復(fù)。在WT和KO的MEF細(xì)胞經(jīng)過(guò)UVB照射后的slotblot結(jié)果顯示,AMPK缺失的MEF細(xì)胞顯著減少了CPD片段修復(fù),但是對(duì)6-4PP修復(fù)無(wú)明顯影響(P＜0.05,Student'st-testandtwo-wayANOVA);在AICAR和metrormin預(yù)處理的小鼠皮膚,紫外線照射后,6小時(shí)CPD修復(fù)增加,但是24小時(shí)的CPD及6-4PP修復(fù)未見(jiàn)改變。AICAR和metf

12、ormin處理的MEF細(xì)胞,紫外線照射后,AMPK-WT細(xì)胞CPD修復(fù)效率提高,但對(duì)AMPK-KO細(xì)胞無(wú)影響。另外,分子水平通過(guò)WesternBlot檢測(cè),我們發(fā)現(xiàn)AMPK缺失的MEF細(xì)胞,XPC表達(dá)明顯減少,同時(shí),AICAR和metformin增加NHEK細(xì)胞的XPC表達(dá)。
　　 4、AICAR和metformin抑制細(xì)胞增殖不依賴于AMPK通路。我們觀察HE染色的對(duì)照組小鼠,AICAR和metformin處理的不同組小鼠上皮

13、增生情況,發(fā)現(xiàn)慢性紫外線照射使小鼠皮膚上皮層厚度增加約10倍,而AICAR和metformin處理組小鼠的上皮增生程度明顯減少;免疫組化檢測(cè)增殖因子Ki67,我們發(fā)現(xiàn)AICAR和metformin處理組小鼠皮膚上皮層Ki67陽(yáng)性細(xì)胞較對(duì)照組明顯減少(P＜0.05,Student'st-test)。這些數(shù)據(jù)表明AICAR和metformin抑制細(xì)胞增殖。為了驗(yàn)證AMPK信號(hào)通路與該抑制作用的關(guān)系,我們研究AICAR和metformin作用

14、于AMPK-WT和KO的MEF細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)AMPK缺失的MEF細(xì)胞在48、72h顯著增加細(xì)胞增殖,AICAR和metformin對(duì)WT和KO的MEF細(xì)胞都有抑制作用,提示我們AMPK通路對(duì)于控制細(xì)胞增殖有重要作用,但是AICAR和metformin的抑制增殖作用不依賴于AMPK通路。
　　 5、我們通過(guò)研究mTOR和ERK通路探索AICAR和metformin抑制細(xì)胞增殖的機(jī)制。WesternBlot結(jié)果發(fā)現(xiàn),在AICAR和met

15、formin處理后的小鼠皮膚,ERK表達(dá)明顯降低,但是mTOR通路下游4EBP1表達(dá)無(wú)明顯改變;AMPK缺失的MEF細(xì)胞,ERK和其上游EGFR表達(dá)均明顯增高,4EBP1表達(dá)仍無(wú)明顯差異,在AMPK-KO細(xì)胞,抑制EGFR表達(dá),減少ERK磷酸化和CyclinD1水平,抑制ERK也降低CVclinD1水平。同樣AICAR和metformin降低NHEK細(xì)胞的ERK活性。這些數(shù)據(jù)顯示AMPK是EGFR/ERK/CyclinD1通路抑制劑。然

16、而,AICAR和metformin不但降低AMPK-WT細(xì)胞ERK活性,同時(shí)降低AMPK-KO細(xì)胞ERK活性,說(shuō)明其對(duì)ERK通路抑制不是通過(guò)AMPK通路,相反,AICAR和metformin對(duì)WT和KO細(xì)胞的EGFR磷酸化均沒(méi)有影響,提示我們AICAR和metformin的作用為EGFR下游ERK上游之間的一個(gè)靶點(diǎn)。
　　 6、在慢性UVB誘導(dǎo)的小鼠皮膚癌模型,至17周時(shí),每只小鼠約發(fā)生3-4個(gè)腫瘤,直徑平均約2-4mm,隨機(jī)分

17、為空白對(duì)照組,metformin外涂(Met-T),metformin口服灌胃(Met-G),結(jié)果顯示應(yīng)用metformin的兩組小鼠均減少了新腫瘤形成,且和對(duì)照組相比明顯抑制已形成腫瘤的生長(zhǎng),口服灌胃組治療效果更明顯(P＜0.05.Smdent'st-test)。WesternBlot結(jié)果顯示在Met-T和Met-G組小鼠照射區(qū)正常皮膚均增加ACC磷酸化,激活A(yù)MPK通路;HE染色發(fā)現(xiàn)Met-T和Met-G組小鼠照射區(qū)非腫瘤部分皮膚增

18、生較對(duì)照組明顯減少;免疫組化結(jié)果顯示Met-T和Met-G組增殖因子Ki67陽(yáng)性細(xì)胞較對(duì)照組明顯減少。
　　 討論：
　　 近年來(lái)關(guān)于磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMPK)-細(xì)胞能量調(diào)節(jié)器的研究很多,研究表明激活A(yù)MPK信號(hào)通路對(duì)腫瘤生長(zhǎng)和存活有抑制作用,該通路激活劑AICAR及經(jīng)典降糖藥物metformin可以通過(guò)激活A(yù)MPK增強(qiáng)其抗腫瘤作用。但是AICAR和metformin是否能調(diào)節(jié)正常細(xì)胞基因組的完整性及其作用機(jī)制未見(jiàn)

19、研究,本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明,AMPK通路在人皮膚腫瘤及紫外線(UVB)誘導(dǎo)小鼠皮膚腫瘤中表達(dá)降低。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,表皮涂抹AMPK激活劑AICAR或metformin可以減少紫外線誘導(dǎo)小鼠皮膚腫瘤形成,在紫外線誘導(dǎo)小鼠腫瘤模型中,表皮涂抹或者口服metformin可以減少新的腫瘤形成并且抑制已形成腫瘤的生長(zhǎng)。機(jī)制研究表明,AICAR和metformin可以通過(guò)AMPK信號(hào)通路促進(jìn)紫外線導(dǎo)致的DNA損傷修復(fù),然而他們卻未依賴于AMPK通路

20、抑制細(xì)胞增殖。我們本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示AICAR和metformin可以通過(guò)促進(jìn)正常皮膚細(xì)胞在受到紫外線照射損傷后的DNA修復(fù),降低因DNA損傷變異發(fā)生腫瘤的幾率。
　　 首先,我們的研究結(jié)果顯示了能量代謝和基因組穩(wěn)定性的關(guān)系,在紫外線誘導(dǎo)的DNA損傷修復(fù)中需要AMPK參與。我們通過(guò)以下幾個(gè)方面的證據(jù)來(lái)驗(yàn)證該結(jié)論:(1)AICAR和metformin促進(jìn)紫外線誘導(dǎo)的小鼠皮膚DNA損傷修復(fù)。(2)AMPK缺失的MEF細(xì)胞DNA損傷修復(fù)被

21、抑制。(3)在AMPK缺失的MEF細(xì)胞,AICAR和metformin促進(jìn)DNA損傷修復(fù)作用消失。分子水平機(jī)制研究中我們發(fā)現(xiàn),核苷酸切除修復(fù)(GG-NER)的關(guān)鍵蛋白XPC,在AMPK缺失的MEF表達(dá)中明顯降低,而AICAR和metformin能夠增加該蛋白的表達(dá),但是關(guān)于AMPK如何調(diào)控XPC的機(jī)制需要進(jìn)一步研究。已有研究證實(shí)環(huán)丁烷嘧啶二聚體(CyclobutanePyrimidineDimer,CPD)是紫外線對(duì)DNA損傷導(dǎo)致皮膚癌

22、的首要環(huán)節(jié),而我們的研究顯示,AMPK通路激活對(duì)增強(qiáng)核苷酸外切修復(fù)(GG-NER)能力具有重要意義,通過(guò)GG-NER修復(fù)CPD,從而減少皮膚癌發(fā)生。
　　 另一方面,我們的研究結(jié)果顯示AICAR和metformin抑制小鼠皮膚上皮細(xì)胞增殖,減少紫外線導(dǎo)致的上皮增生。AMPK通過(guò)抑制有絲分裂EGFR/ERK通路抑制細(xì)胞增殖,相反,AICAR和metformin均抑制ERK通路但是對(duì)EGFR表達(dá)無(wú)明顯影響。AICAR和metform

23、in抑制細(xì)胞增殖及對(duì)ERK通路的抑制不依賴于AMPK通路,因?yàn)槲覀兊难芯拷Y(jié)果發(fā)現(xiàn)在AMPK缺失的MEF細(xì)胞,AICAR和metformin的細(xì)胞生存抑制作用及ERK通路的抑制作用仍然存在。但是有趣的是,前人的關(guān)于AICAR/AMPK和ERK通路的研究結(jié)果與我們的研究結(jié)果正好相反。在胚胎成纖維細(xì)胞(NIH-3T3)和心肌纖維細(xì)胞,AICAR抑制生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)的ERK通路激活,這個(gè)作用是通過(guò)AMPK通路但是與EGFR表達(dá)無(wú)關(guān);相反在白血病K5

24、62細(xì)胞,ERK激活需要AMPK,所以我們總結(jié)AICAR調(diào)節(jié)ERK通路的作用是細(xì)胞特異性的,與細(xì)胞系有關(guān)。我們的研究結(jié)果顯示,在皮膚細(xì)胞及小鼠成纖維細(xì)胞(MEF),AICAR和metformin抑制ERK通路既不依賴于AMPK通路也不依賴于EGFR通路。另外,雖然已有研究結(jié)果表明AMPK和metformin抑制mTOR通路,但是我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),在小鼠皮膚細(xì)胞和小鼠成纖維細(xì)胞系MEF,AICAR和metformin并沒(méi)有影響mTOR信

25、號(hào)通路活動(dòng)。實(shí)際上,一個(gè)關(guān)于膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的研究結(jié)果顯示,盡管AICAR沒(méi)有像mTOR信號(hào)通路抑制劑雷帕霉素那樣明顯抑制mTOR信號(hào)通路,但是它對(duì)該細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用卻比雷帕霉素強(qiáng),這一結(jié)果無(wú)疑是對(duì)mTOR信號(hào)通路抑制作用的一個(gè)挑戰(zhàn)。下一步,我們將繼續(xù)研究AICAR和metformin對(duì)ERK通路抑制及控制增殖的分子機(jī)制,進(jìn)一步闡明mTOR在AICAR和metformin治療腫瘤作用中的作用機(jī)制。
　　 總之,我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,

26、AMPK激活劑AICAR和metformin可以抑制紫外線誘導(dǎo)的皮膚腫瘤,他們通過(guò)激活A(yù)MPK通路促進(jìn)紫外線誘導(dǎo)的DNA損傷修復(fù),但是他們通過(guò)抑制ERK通路抑制細(xì)胞增殖作用是非AMPK通路依賴的。我們的研究結(jié)果顯示,AICAR和廣泛應(yīng)用的抗代謝藥物metformin對(duì)紫外線輻射誘導(dǎo)皮膚腫瘤具有潛在的化學(xué)預(yù)防作用,尤其是對(duì)于有皮膚癌病史的患者更有價(jià)值。
　　 結(jié)論：
　　 1、AMPK信號(hào)通路在人皮膚鱗癌細(xì)胞和慢性紫外線照

27、射誘導(dǎo)的小鼠皮膚腫瘤中被抑制。
　　 2、激活A(yù)MPK信號(hào)通路抑制紫外線誘導(dǎo)的SKH-1無(wú)毛小鼠腫瘤生成。
　　 3、AICAR和metformin通過(guò)激活A(yù)MPK信號(hào)通路增加紫外線誘導(dǎo)的DNA損傷修復(fù)。
　　 4、AICAR和metformin抑制細(xì)胞增殖是AMPK信號(hào)通路非依賴性的。
　　 5、AICAR和metformin抑制MEF細(xì)胞及皮膚腫瘤中ERK信號(hào)通路。
　　 6、在慢性紫外線照射