1、該研究旨在利用瘧原蟲的乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)為診斷靶抗原,通過對該蛋白進行克隆、表達,制備單抗,并篩選、配對建立反應模式等系列研究,開發(fā)用于瘧疾快速診斷的免疫層析檢測試劑盒.研究中,首先將惡性瘧原蟲的LDH(Plasmodium falciparum lactate dehydrogenase,LDHpf)基因克隆至pET-23a(+)表達載體中,構建pET23-LDH重組質粒.重組質粒在BL2

2、1中得到高效表達,SDS-PAGE顯示表達蛋白分子量約為33KDa,與先前報道的瘧原蟲LDH分子量理論值(31-36Kda)基本符合.表達產物冰浴超聲破菌,發(fā)現(xiàn)目的蛋白大部分溶于上清中,為可溶性表達,密度掃描顯示目的蛋白占菌體總蛋白的41.2％.采用Q-Sepharose High Performance陰離子交換樹脂柱層析對pET23-LDH重組蛋白進行純化,SDS-PAGE電泳經(jīng)凝膠光密度圖象分析系統(tǒng)檢測主蛋白純度可達89.1%,濃

3、度為400μg/ml.用純化的重組蛋白免疫BALB/c小鼠制備免疫血清,ELISA結果顯示免疫小鼠血清與pET23-LDH表達產物出現(xiàn)明顯反應,而對空載體PET-23a表達產物無反應.Westernblot分析表明特異性區(qū)帶出現(xiàn)在33kDa處,而空載體誘導后表達的產物無區(qū)帶出現(xiàn).進一步用該免疫血清與惡性瘧原蟲和間日瘧原蟲反應,Western blot結果表明免疫血清能識別惡性瘧原蟲和間日瘧原蟲33KDa處蟲源蛋白,而與未感染的紅細胞不發(fā)

4、生交叉反應,提示pET23-LDH重組蛋白具有良好的抗原性和免疫原性.以純化后的LDH重組蛋白免疫BALB/c小鼠,取其脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞SP2/0進行融合,融合細胞用HAT培養(yǎng)基作選擇性培養(yǎng).采用間接ELISA法篩選陽性雜交瘤細胞株,獲得11株能分泌高效價和高特異性的抗LDH重組蛋白單抗的雜交瘤細胞株.Ig類與亞類鑒定結果為2B11、3C9、3D1 0、6D3、7D2、1E7、6G7、1C6、2D7重鏈類型為I g G 1亞類,輕