1、背景及目的新生兒肺出血(neonatalpulmonaryhemorrhage，NPH)是新生兒期危重急癥之一，圍產(chǎn)期缺氧/窒息是NPH的主要病因之一，其主要病理生理改變?yōu)榉蝿?dòng)脈高壓和肺血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷。缺氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxiainduciblefactor-1，HIF-1)是機(jī)體細(xì)胞適應(yīng)低氧的主要中介物質(zhì)，通過它進(jìn)而對其下游的一系列缺氧反應(yīng)基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，從而產(chǎn)生一系列病理生理反應(yīng)。內(nèi)皮素-1(endothelin-1，ET

2、-1)是血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌的一種重要的縮血管因子，ET-1基因是缺氧反應(yīng)基因之一。我們的前期研究工作初步證實(shí)HIF-1α可通過調(diào)節(jié)ET-1而參與內(nèi)皮細(xì)胞損傷及肺出血的形成。 RNA干擾(RNAinterference，RNAi)是指雙鏈RNA(double-strandedRNA，dsRNA)介導(dǎo)的序列特異性轉(zhuǎn)錄后同源靶基因沉默現(xiàn)象，RNAi技術(shù)是一種簡單有效的替代基因敲除、研究基因功能的有力工具。為應(yīng)用這一技術(shù)研究HIF-1在缺

3、氧過程中的作用，我們采用HIF-1αsiRNA重組腺病毒(AdsiHIF-1α)為主要實(shí)驗(yàn)工具，該AdsiHIF-1α是來源于我們的另一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)研究。該研究中，我們根據(jù)基因庫提供的資料，選擇人HIF-1α基因的不同位點(diǎn)，設(shè)計(jì)合成了6對相應(yīng)的siRNA寡核苷酸序列，制備了siRNA重組穿梭載體，并將其和復(fù)制缺陷型腺病毒載體同源重組，得到帶有外源DNA的重組腺病毒載體，轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞后得到能轉(zhuǎn)錄出HIF-1α基因siRNA的復(fù)制缺陷型腺

4、病毒。利用此腺病毒感染細(xì)胞或動(dòng)物，可將HIF-1α基因siRNA轉(zhuǎn)入靶細(xì)胞或靶組織，實(shí)現(xiàn)HIF-1α基因的RNAi。腺病毒是轉(zhuǎn)基因技術(shù)的常用載體，它可穩(wěn)定地將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞并表達(dá)，而且效率高，宿主細(xì)胞范圍廣泛，易于制取、純化、濃縮，是實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確、高效RNA干擾的理想工具。 本實(shí)驗(yàn)的目的，是利用在大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞(ratpulmonarymicrovascularendothelialcells，RPMVECs)培養(yǎng)液中加

5、入CoCl2以模擬細(xì)胞缺氧環(huán)境(此方法操作簡便，條件易控制，試驗(yàn)結(jié)果與缺氧基本一致)，和AdsiHIF-1α感染RPMVECs的方法，通過對HIF-1α和ET-1基因表達(dá)的干擾，研究HIF-1α和ET-1基因在大鼠RPMVECs缺氧過程中的作用。為下一步將“在RPMVECs的研究”轉(zhuǎn)為“在體內(nèi)的研究”奠定基礎(chǔ)，為研究新生兒肺出血發(fā)病機(jī)制提供更為深化的理論依據(jù)。 方法1、原代培養(yǎng)RPMVECs：取出生1天的SD乳鼠周邊肺組織，剪成

6、1mm×1mm×1mm的組織塊，貼入無菌的6孔板，每孔5～10塊，同時(shí)加入含20％胎牛血清、肝素90U/ml、VEGF50ng/ml、青霉素100U/ml和鏈霉素100μg/ml的“完全DMEM”培養(yǎng)基1ml，放入37℃5％CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。1h補(bǔ)充足量培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。60h后取出肺組織塊，更換“完全DMEM”培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)5d～7d后進(jìn)行傳代。 2、復(fù)蘇凍存的人胚腎上皮細(xì)胞(HEK293細(xì)胞)并傳代培養(yǎng)。利用在培養(yǎng)基中加

7、入原代HIF-1αsiRNA重組腺病毒的方法，在HEK293細(xì)胞中大量擴(kuò)增HIF-1αsiRNA重組腺病毒，測定滴度，備下一步實(shí)驗(yàn)。相同的方法擴(kuò)增對照腺病毒(Ad/null，為未插入外源基因的空載體重組腺病毒，故不能轉(zhuǎn)錄出HIF-1αsiRNA)。 3、HIF-1αsiRNA重組腺病毒干擾大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞HIF-1α及ET-1基因的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)分組： A組(正常對照)：常氧下(5％CO2、95％空氣、37℃)培養(yǎng)。

8、 B組(CoCl2刺激)：含100μMCoCl2培養(yǎng)基培養(yǎng)4h。 C組(重組腺病毒感染24h+CoCl2)：Ad/siHIF-1α感染24h后，加入CoCl2(終濃度100μM)繼續(xù)培養(yǎng)4h。 D組(重組腺病毒感染48h+CoCl2)：Ad/siHIF-1α感染48h后，加入CoCl2(終濃度100μM)繼續(xù)培養(yǎng)4h。 E組(重組腺病毒感染72h+CoCl2)：Ad/siHIF-1α感染72h后，加入CoCl

9、2(終濃度100μM)繼續(xù)培養(yǎng)4h。 F組(對照腺病毒感染72h+CoCl2)：Ad/null感染72h后，加入CoCl2(終濃度100μM)繼續(xù)培養(yǎng)4h。 各組按以上方法處理后，采用熒光定量PCR法檢測HIF-1α和ET-1基因水平，Westernblotting法檢測HIF-1α蛋白表達(dá)水平，ELISA法檢測ET-1蛋白表達(dá)水平，以觀察HIF-1αsiRNA重組腺病毒對缺氧RPMVECs的HIF-1α及其下游基因ET

10、-1的表達(dá)調(diào)控作用。 結(jié)果1、肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞通過倒置相差顯微鏡觀察，細(xì)胞呈鵝卵石鑲嵌狀排列，狀如梭形或多角形，大小均勻，胞核清晰，呈卵圓形，胞漿豐富。免疫組化染色顯示，內(nèi)皮細(xì)胞Ⅷ因子相關(guān)抗原陽性，經(jīng)鑒定完全符合肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞特征。 2、在30代以內(nèi)的293細(xì)胞中擴(kuò)增出AdsiHIF-1α，經(jīng)倍比終點(diǎn)稀釋法測定，病毒滴度為2×109pfu/ml。 3、熒光定量PCR檢測HIF-1α及ET-1基因mRNA水平，結(jié)

11、果顯示：(1)正常對照組A的HIF-1αmRNA相對含量為1.0±0.00。CoCl2刺激組B的HIF-1αmRNA相對含量為1.12±0.05，與A組比較上調(diào)不明顯(P＞0.05)。AdsiHIF-1α感染24h、48h、72h的C、D及E組HIF-1αmRNA相對含量分別為0.45±0.02、0.31±0.01及0.27±0.01，相對于B組分別下調(diào)了60％、72％及76％(P＜0.05)。對照病毒感染組F的HIF-1αmRNA相對

12、含量為1.17±0.08，相對于B組上調(diào)了4％(P＞0.05)。 (2)正常對照組A的ET-1mRNA相對含量為1.0±0.00。CoCl2刺激組B的ET-1mRNA相對含量為5.65±0.80，與A組比較明顯上調(diào)(P＜0.05)。AdsiHIF-1α感染24h、48h、72h的C、D及組E的ET-1mRNA相對含量分別為2.34±0.28、1.46±0.26及1.16±0.41，相對于B組分別下調(diào)了59％、74％、79％(P＜

13、0.05)。對照病毒感染組F的HIF-1αmRNA相對含量為5.60±0.87，相對于B組下調(diào)了1％(P＞0.05)。 4、Westernblot檢測HIF-1α蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示：正常對照組A的HIF-1α蛋白相對含量為0.258±0.020。CoCl2刺激組B的HIF-1α蛋白相對含量為0.948±0.015，與A組比較明顯上調(diào)(P＜0.05)。AdsiHIF-1α感染24h、48h、72h的C、D及E組HIF-1α蛋白相

14、對含量分別為0.438±0.019、0.345±0.010和0.331±0.014，相對于B組分別下調(diào)了54％、64％及65％(P＜0.05)。對照病毒感染組F的HIF-1α蛋白相對含量為0.929±0.028，相對于B組下調(diào)了2％(P＞0.05)。 5、ELISA檢測ET-1蛋白水平，結(jié)果顯示：正常對照組A的ET-1蛋白含量為13.22±0.69，CoCl2刺激組B的ET-1蛋白含量為94.39±1.00pg/ml，與A組比較

15、明顯上調(diào)(P＜0.05)。AdsiHIF-1α感染24h、48h、72h的C、D及組E的ET-1蛋白含量分別為51.42±2.18、44.80±1.51及42.77±1.09，相對于B組分別下調(diào)了46％、53％及55％(P＜0.05)。對照病毒感染組F的ET-1蛋白含量為93.17±2.20，相對于B組下調(diào)了1％(P＞0.05)。 結(jié)論1、成功培養(yǎng)了大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞，是一種較為理想的研究人體肺組織細(xì)胞病理生理改變的體外模型。

16、 2、我們前期研究工作構(gòu)建的HIF-1αsiRNA重組腺病毒(AdsiHIF-1α)能夠有效沉默缺氧誘導(dǎo)的大鼠肺血管內(nèi)皮細(xì)胞HIF-1α基因、繼而影響其下游ET-1基因的表達(dá)。HIF-1α及ET-1基因與大鼠肺血管內(nèi)皮細(xì)胞的缺氧過程密切相關(guān)，從而參與了缺氧誘導(dǎo)的肺血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷及最終導(dǎo)致新生兒肺出血的發(fā)生、發(fā)展過程。我們構(gòu)建的AdsiHIF-1α可作為基因沉默的工具，為下一步在動(dòng)物體內(nèi)研究HIF-1α及其下游基因ET-1在新生