1、新生兒急性肺損傷是新生兒時期常見疾病和主要致死原因之一，國內外研究認為缺氧肺損傷的發(fā)病機理主要是：缺氧缺血直接導致肺泡上皮細胞及血管內皮細胞水腫、壞死；氧自由基損傷；細胞因子損傷等。近年來有研究認為肺泡上皮細胞凋亡及相關基因表達異?？赡苁切律鷥悍螕p傷的重要發(fā)病機制之一。HIF-1α是細胞對缺氧適應反應的主要轉錄因子，它在許多細胞事件中起作用，目前認為HIF-1α在缺氧肺泡上皮細胞凋亡中意義重大。研究缺氧肺損傷AEC凋亡的相關機制及減少其

2、凋亡是防治新生兒肺損傷的一個新策略。 目的: 1．觀察缺氧誘導大鼠肺泡上皮細胞株(CCL149,L<,2>型)的凋亡變化，研究凋亡在缺氧肺泡上皮細胞損傷中的作用； 2．初步探討HIF-1α在缺氧誘導CCL149凋亡中的意義，為進一步研究新生兒缺氧肺損傷的發(fā)病機制提供實驗基礎； 3．應用HIF-1αsiRNA對CCL149進行體外干預并評估干擾效果，為防治新生兒肺損傷提供一個新策略及方向。 方法:

3、 1．以CCL149為研究對象，選擇5種不同濃度氯化鈷 (Cobalt chloride,CoCl<,2>)作用CCL149，采用MTT法檢測各濃度4個時點(4、12、24、48小時)細胞生長抑制率，根據(jù)半數(shù)抑制濃度(IC<,50>)篩選出COCl<,2>合適劑量建立細胞體外缺氧模型。 2．利用脂質體將構建好的HIF-1αsiRNA轉染至CCL149，通過熒光顯微鏡觀察熒光HIF-1α siRNA對缺氧誘導肺泡上皮細胞凋亡

4、影響的實驗研究及RT-PCR方法檢測其轉染效果，檢驗HIF-1αtsiRNA在CCL149的有效性。 3．實驗分為兩大組：對照組，包括正常組和單純缺氧組(分別缺氧4、24、48小時組)：HIF-1α siRNA干預組，包括轉染后分別缺氧4、24、48小時組。采用Hoechst33342染色熒光顯微鏡、Annexin V/PI雙染流式細胞儀檢測各組凋亡變化，采用透射電子顯微鏡觀察缺氧時CCL149凋亡典型形態(tài)學變化。 4．

5、采用實時熒光定量PCR、Western Blot檢測各組HIF-1α mRNA、蛋白水平變化，結合各組凋亡率，評價HIF-1αsiRNA抑制缺氧誘導CCL149凋亡的效應。 結果: 1．不同濃度COCl<,2>對CCL149的生長抑制率：MTT結果顯示，相同作用時間下，隨著CoCl<,2>濃度增加，細胞生長抑制率增加；相同作用濃度下，隨著CoCl<,2>作用時間增加，細胞生長抑制率增加；通過描繪生長抑制曲線，我們得出作用

6、CCL149 24h半數(shù)抑制濃度為467 μmol/L，在后續(xù)的研究中選擇500 μmol/L濃度COCl<,2>作用細胞建立體外細胞缺氧模型。 2．HIF-1αsiRNA能有效沉默缺氧引起CCL149中HIF-1αmRNA表達：PEGFP-luc轉染CCL149 48h后熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光，轉染效率50％以上；RT-PCR結果顯示：正常組HIF-1αmRNA相對含量為0.906±0.076，缺氧24h組HIF-1αmR

7、NA相對含量為1．576__+0．048，與正常組比較有顯著性差異(P<0．01)，轉染后缺氧24h組HIF-1αmRNA相對含量為0.674±0.035，較缺氧24h組下調57％(P<0.01)。 3．COCl<,2>模擬缺氧可誘導CCL149凋亡：透射電鏡檢測出CCL149凋亡典型形態(tài)學變化，缺氧24h細胞出現(xiàn)體積變小，染色質致密固縮聚集于胞核，核質沿核膜內側排列等現(xiàn)象；熒光顯微鏡觀察，缺氧4h出現(xiàn)散在凋亡細胞，凋亡細胞核可

8、見濃染致密的顆粒塊狀熒光，染色不均勻，正常組、單純缺氧4h、24h、48h組凋亡率(％)分別為：1.50±0.50、5.83±0.76、15.00±3.28、51.50±3.00，隨缺氧時間增加CCL149凋亡率增加(P<0.05)；流式細胞儀分析顯示，正常組、單純缺氧4h、24h、48h組早期凋亡率(％)分別為：0.379±0.113、4.317±0.055、18.506±2.274、12.768±2.245，單純缺氧組與正常組比較凋

9、亡率有增加(P<0.01)，缺氧48小時細胞出現(xiàn)壞死現(xiàn)象。 4．HIF-1α對缺氧CCL149細胞凋亡的調控：正常組HIF-1α蛋白相對含量為0.21±HIF-1α siRNh對缺氧誘導肺泡上皮細胞凋亡影響的實驗研究0.026，單純缺氧4h、24h、48h組HIF-1α蛋白相對含量分別為0.69±0.035、1.02±0.044、0.71±0.046，較正常組明顯增強(P<0.01)。經Pearson相關分析，單純缺氧組HIF-

10、1α蛋白表達與其凋亡率變化呈正相關(R=0.707，P=0.01)。 5. HIF-1α siRNA對缺氧CCL149細胞凋亡的影響：HIF-1α siRNA干預后缺氧4h、24h、48h組HIF-1α mRNA相對含量分別為：0.32±0.03、0.39±0.23、0.40±0.10，與單純缺氧各組比較HIF-1α mRNA分別下調72％、70％、67％(P值均<0.01)；干預后缺氧4h、24h、48h組HIF-1α蛋白相對

11、含量分別為：0.25±0.046、0.23±0.072、0.28±0.079，與單純缺氧各組比較HIF-1α蛋白分別下調64％、77％、60％(P值均<0.01)。與此同時，熒光顯微鏡檢測HIF-1α siRNA干預4h、24h、48h組凋亡率(％)分別為2.17±0.76、8.17±0.76、14.33±1.04，與單純缺氧各組凋亡率比較明顯降低(P值均<0.01)；流式細胞儀檢測HIF-1α siRNA干預4h、24h、48h組早期

12、凋亡率(％)分別為3.559±0.186、1.279±0.489、0.924±0.151，與單純缺氧各組凋亡率比較明顯降低(P值均<0.01)。經Pearson相關分析，HIF-1αmRNA與細胞凋亡率呈正相關(R=0.749，P<0.001)HIF-1α蛋白水平與細胞凋亡率呈正相關(熒光顯微鏡檢測法，R=0.894，P=0.001；流式細胞儀檢測法，R=0.781，P=0.013)。 結論: 1.通過在培養(yǎng)液加入COC

13、l<,2>建立了體外AEC缺氧模型，前期實驗構建好的HIF-1α siRNA轉染至AEC并能夠有效的下調其HIF-1αmRNA表達，是沉默AEC中HIF-1α的有效工具。 2.缺氧可以誘導AEC凋亡，隨缺氧時間延長，細胞凋亡率增加，提示了AEC凋亡參與了缺氧肺損傷的發(fā)病機制。 3.缺氧誘導凋亡時HIF-1α蛋白表達增加，同時HIF-1α siRNA可以通過降低HIF-1αmRNA、蛋白表達而減少缺氧誘導的AEC凋亡，提示