1、目的：應用酵母雙雜交系統(tǒng)和免疫熒光技術研究野生型和變異型LRR(I1122V)主域在體外與parkin分子之間是否存在相互作用，為逐個解析LRRK2蛋白其他主域的功能，全面探討LRRK2蛋白在帕金森病發(fā)病機制中作用的后續(xù)研究奠定基礎。 方法：通過分子克隆技術構建誘餌pGBDU-LRR質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染進入酵母菌成為PJ69-4α/pGBDU-LRR菌株，應用酵母雙雜交系統(tǒng)在獵物書架中篩選出可能與野生型LRRK2蛋白的LRR主域存在相互作

2、用的蛋白。隨后分別轉(zhuǎn)染含F(xiàn)LAG標記的PRK5-parkin質(zhì)粒(對照組)，HA標記的野生型pCMV-LRR質(zhì)粒+PRK5-parkin質(zhì)粒(實驗組1，parkin+LRR(W))，HA標記的變異型pCMV-LRR質(zhì)粒+PRK5-parkin質(zhì)粒(實驗組2，parkin+LRR(M))，采用Hoechst染色試劑盒檢測細胞凋亡，wesmm blot檢測parkin蛋白和野生型/變異型LRR主域的表達，免疫熒光技術進一步觀察野生型/變異型

3、LRR主域在細胞內(nèi)是否共定位，免疫沉淀技術證實LRR主域在體外與。parkin分子之間是否存在相互作用。 結果：通過酵母雙雜交系統(tǒng)從獵物書架中篩選出parkin分子可能與野生型LRR主域之間存在相互作用，通過共同轉(zhuǎn)染野生型/變異型pCMV-HA-LRR質(zhì)粒和PRK5-FLAG-parkin質(zhì)粒進入HEK293細胞，western blot檢測到parkin蛋白和野生型/變異型LRR主域在HEK293細胞成功表達，免疫熒光技術觀察

4、到parkin在細胞胞漿中表達(綠色熒光)，野生型LRR亦在細胞胞漿中表達(紅色熒光)，融合后，可見parkin與野生型LRR共同轉(zhuǎn)染的HEK293細胞胞漿呈橙色，說明兩者之間在細胞內(nèi)共定位，可能存在相互作用；然而變異型LRR在HEK293細胞的胞核中形成包涵體，融合后核內(nèi)的包涵體仍然為紅色，說明parkin與變異型LRR在體外表達時細胞內(nèi)定位不同，兩者之間沒有相互作用。免疫沉淀實驗進一步證實parkin分子與野生型LRR主域之間存在相

5、互作用。Hoechst染色發(fā)現(xiàn)細胞凋亡比率較對照組、實驗組1明顯升高，免疫熒光也表明實驗組2的細胞核內(nèi)有類似于路易體的包涵體形成，所以我們建立了帕金森病的細胞模型。 結論：野生型LRRK2蛋白的LRR主域在體外表達時與parkin位于細胞內(nèi)同一亞結構，兩者之間存在相互作用。突變的LRR主域(I1122V)與parkin之間的相互作用缺失。變異型LRRK2蛋白之LRR主域與parkin在體外共同表達時可以形成類似路易體樣的細胞核內(nèi)