1、第一部分LRRK2基因相關(guān)microRNAs的預測及驗證
　　帕金森病(Parkinson Disease，PD)是一種常見的神經(jīng)變性疾病。PD的發(fā)病機制十分復雜，目前認為其是由遺傳因素與環(huán)境因素的共同作用所導致的。PD遺傳致病機制的研究已取得明顯進展，迄今已定位16個PD相關(guān)位點，克隆了包括富亮氨酸重復激酶2基因(Leucine-rich repeat kinase2，LRRK2)在內(nèi)的11個致病基因，LRRK2不僅是常染色體顯

2、性遺傳性PD重要致病基因，還與部分原發(fā)性PD有關(guān)。
　　目前LRRK2基因突變導致PD發(fā)生的機制并不十分清楚，但研究提示某些LRRK2致病突變（如G2019S）可能引起其激酶功能增強而具有細胞毒性，并且過表達野生型LRRK2也具有細胞毒性作用。此外LRRK2可能參與PD發(fā)生過程中異常蛋白沉積。過表達野生型LRRK2、LRRK2-G2019S突變體或LRRK2激酶結(jié)構(gòu)域可加速α-Synuclein A53T的聚集。由此可見，對LRR

3、K2的表達和功能的精確調(diào)控在PD發(fā)病機制中具有重要作用。
　　MicroRNA(miRNA)是一類由內(nèi)源基因編碼的長度約為21-23個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，由具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的約70-90個堿基大小的單鏈RNA前體經(jīng)過Dicer酶加工后生成，有5'端磷酸基和3'羥基，定位于RNA前體的3'端或5'端。在不同組織、不同發(fā)育階段中miRNA的水平有顯著差異，這種miRNAs表達模式具有分化的位元相性和時序性(differentia

4、l spatial and temporal expression pattems)，因此miRNAs作為參與調(diào)控基因表達的分子具有重要意義。本課題將探討miRNA對LRRK2基因表達調(diào)控機制在PD發(fā)病機制中的作用。
　　方法:通過UCSC Genome Bioinformatics數(shù)據(jù)庫(http://genome.ucsc.edu/)查詢LRRK2基因的RefSeq序列，根據(jù)查詢到的LRRK2基因3，UTR序列運用target

5、scan（http://www.targetscan.org/），miRanda（http://www.microrna.org/microma/home.do)等根據(jù)LRRK2基因3'UTR序列預測能對其進行轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的microRNAs，從miRbase數(shù)據(jù)庫獲得相關(guān)microRNAs序列，比對生物信息學軟件的預測結(jié)果，選擇評分值高的microRNAs進行生物學驗證。構(gòu)建野生型及突變型LRRK2基因3'UTR序列熒光素酶報告基因載體

6、，在N2a細胞中與miRNAs瞬時共轉(zhuǎn)染，于轉(zhuǎn)染后24小時及48小時進行熒光素酶活性分析，驗證miRNAs對LRRK2基因mRNA的轉(zhuǎn)錄后抑制作用。瞬時轉(zhuǎn)染miRNAs進入HEK293細胞系，于轉(zhuǎn)染后24小時及48小時檢測內(nèi)源性LRRK2蛋白表達水平。根據(jù)共轉(zhuǎn)microRNA后熒光素酶報告系統(tǒng)活性以及細胞系體內(nèi)的內(nèi)源性LRRK2蛋白表達水平判斷，二者均具有統(tǒng)計學意義時判定該microRNA分子對LRRK2基因具有轉(zhuǎn)路后抑制作用。

7、　　結(jié)果:本研究對LRRK2基因的RefSeq序列NM_198578的全長3'UTR序列共1517個堿基進行分析，以蛋白翻譯終止位點“TAG”的G堿基為+1位進行描述，結(jié)合TargetScan預測結(jié)果顯示hsa-miR-205與LRRK2基因3'UTR序列結(jié)合位點+116-122具有高保守性，107個人類miRNAs分子與人類LRRK2基因3'UTR序列存在保守性較低的潛在結(jié)合性;miRanda預測結(jié)果顯示57個人類miRNAs分子與人

8、類LRRK2基因3'UTR序列存在潛在結(jié)合性，選取23個潛在調(diào)控miRNAs進行生物學驗證，結(jié)果顯示hsa-miR-205 mimics與攜帶野生型LRRK2基因3'UTR序列以及位點+116-122突變型LRRK2基因3'UTR序列的Luc報告系統(tǒng)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染N2a細胞株后，攜帶野生型組的Luc報告基因相對活性下降，t檢驗顯示差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，t=6.479，95％CI值為-1.614～-0.617）;hsa-miR-4

9、54 mimics與構(gòu)建的攜帶野生型LRRK2基因3'UTR序列以及位點+506-512突變型LRRK2基因3'UTR序列的Luc報告系統(tǒng)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染N2a細胞株后，野生型組的Luc報告基因相對活性明顯下降，t檢驗顯示差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.001，t=6.479，95％CI值為-1.614～-0.617)。瞬時轉(zhuǎn)染hsa-miR-205、hsa-miR-301b及hsa-miR-454 mimics進HEK293細胞于24小時及48

10、小時檢測內(nèi)源性LRRK2表達，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染hsa-miR-205mimics后內(nèi)源性LRRK2蛋白生成明顯減少，轉(zhuǎn)染hsa-miR-454 mimics后內(nèi)源性LRRK2蛋白生成減少，而轉(zhuǎn)染hsa-miR-301b mimics后HEK293細胞的內(nèi)源性LRRK2蛋白減少不明顯。
　　結(jié)論:hsa-miR-205可與LRRK2基因3'UTR序列的5，-AUGAAGG-3'互補結(jié)合，抑制LRRK2基因的表達;hsa-miR-454可

11、與LRRK2基因3，UTR序列的5'-UUGCACU-3'互補結(jié)合，抑制LRRK2基因的表達;hsa-miR-301b可能與LRRK2基因3'UTR序列的5'-UUGCACU-3'互補結(jié)合，抑制LRRK2基因的表達，但仍需深入研究。
　　第二部分miRNAs及LRRK2 mRNA在干細胞-神經(jīng)元分化細胞系的表達水平研究
　　組織發(fā)育與生理過程中的穩(wěn)態(tài)通過于細胞與組織干細胞的調(diào)控完成，是否存在一些細胞內(nèi)機制介導干細胞間的信號轉(zhuǎn)

12、導、表觀遺傳，轉(zhuǎn)錄，翻譯以及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控水平的分化基因表達等細胞內(nèi)機制。microRNA，作為基因表達、修飾、轉(zhuǎn)錄和翻譯的調(diào)節(jié)者，在干細胞的自我復制、定向分化和組織再生中起著十分重要的作用。它是干細胞特性、維持、轉(zhuǎn)化功能的一個關(guān)鍵調(diào)控者，參與細胞周期、細胞重建(Reprograming)、多能干細胞生成、信號傳遞、特異分化、聚集、修復、再生、變異、代謝等所有過程，是當前干細胞調(diào)控研究的一個重點。
　　LRRK2基因是PD發(fā)病的重要致

13、病基因，而病理學研究表明LRRK2蛋白廣泛表達于所有腦組織，但以多巴胺能神經(jīng)支配區(qū)為主。對大鼠的胚胎發(fā)育中神經(jīng)元與神經(jīng)元附屬組織的LRRK2 mRNA表達研究表明LRRK2可能在控制神經(jīng)元細胞的增殖、遷移以及分化過程中發(fā)揮作用。本章節(jié)將在驗證miR-454及miR-205對LRRK2基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的基礎上初步探討miR-454及miR-205與LRRK2在胚胎干細胞向神經(jīng)元的分化過程中不同分化階段胚胎干細胞及胎腦組織的表達之間的相關(guān)性，

14、為進一步深入研究miRNAs與LRRK2在神經(jīng)元增殖、遷移以及分化過程中的作用奠定基礎。
　　方法:分化人源胚胎干細胞hESCs H9-P57細胞(ES)，分別收集ES，擬胚體(EB)，神經(jīng)前體細胞以及人類胎腦組織共3個不同胚胎發(fā)育階段的細胞及組織，提取總RNA，應用實時熒光定量PCR檢測miRNAs，LRRK2基因mRNA的表達水平;提取胎腦組織蛋白，應用western blotting技術(shù)檢測胎腦組織中LRRK2蛋白的表達水平

15、。
　　結(jié)果:相對定量PCR結(jié)果顯示LRRK2 mRNA在胚胎分化的前期到神經(jīng)前體細胞階段表達均很低，在擬胚體階段甚至檢測不到LRRK2 mRNA，而在發(fā)育到26周的有成熟神經(jīng)元細胞存在的胎腦組織中LRRK2 mRNA則呈現(xiàn)高表達，其中以包含大腦皮質(zhì)及髓質(zhì)結(jié)構(gòu)的組織表達最高，僅有皮質(zhì)結(jié)構(gòu)的腦組織表達量較前者低，而在小腦中則表達更低;miR-454在胚胎干細胞，擬胚體階段以及神經(jīng)前體細胞階段的表達均較低，而在發(fā)育到26周的胎腦組織中

16、表達則升高，在胎大腦組織（包括大腦皮質(zhì)及髓質(zhì)）中的表達多于大腦皮層組織內(nèi)的表達，大腦皮質(zhì)及小腦組織中miR-454表達水平相當;miR-205在胚胎干細胞，擬胚體階段存在表達，神經(jīng)前體細胞階段基本沒有miR-205的表達，但在發(fā)育到26周的胎腦組織中均有表達，在胎大腦組織（包括大腦皮質(zhì)及髓質(zhì)）相對較低，而小腦中表達相對較高。胎小腦組織中LRRK2蛋白表達最高，胎大腦組織（包括大腦皮質(zhì)及髓質(zhì)）相對較低，僅包含皮質(zhì)的胎腦組織中表達最低。

17、r>　　結(jié)論:miR-454及miR-205在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中存在表達;miR-205在胚胎干細胞分化過程中存在表達。
　　第三部分帕金森病患者血清miRNAs表達水平檢測
　　miRNAs是一類內(nèi)源性表達的短小的，非編碼RNAs，可通過調(diào)控眾多基因表達在不同生理功能中發(fā)揮作用。miRNAs主要與靶基因的mRNAs的3'UTR序列的結(jié)合位點相結(jié)合通過降解靶基因的mRNAs或者減少靶基因蛋白翻譯而達到轉(zhuǎn)錄后抑制作用。目前研究顯示

18、miRNAs表達異常與眾多疾病的發(fā)生相關(guān)， miRNAs的表達異?？赡茏鳛闈撛诘募膊≡\斷標志物或者與疾病相關(guān)的miRNAs可能成為潛在的疾病治療靶點。多項研究顯示人類血清或者血漿中存在由組織釋放的游離miRNAs，并且這些游離miRNAs表達具有穩(wěn)定性，可再生性，在同一個體中表達水平一致，并不易被自身血液系統(tǒng)中的RNAse酶降解等特性，研究表明一些疾病如肺癌、前列腺癌等患者血清中游離miRNAs與正常人比較表達存在差異，因此目前認為血清

19、中的miRNAs可能作為診斷癌癥等某些疾病的標志物。
　　多年來，眾多研究組致力于尋找準確診斷PD的生物標志物與生理學檢查，但是目前并沒有找到確鑿的診斷標志物，因此檢測PD患者腦脊液，或者血液中的miRNAs水平看是否能作為包括PD在內(nèi)的神經(jīng)變性病的診斷標志物或者治療靶點。本研究在前面章節(jié)的研究基礎上，進一步檢測PD患者與正常對照血清中是否存在游離miR-205及miR-454水平差異性作為一種尋找PD生物標志物的探索性研究。

20、r>　　方法:采集16例散發(fā)性PD患者以及20例正常對照者5ml靜脈血，促凝管靜置4-6小時，分離血清于-70℃保存，應用Ambion-mirVanaTM PARIS TMkit進行游離小RNAs分離，測OD，應用Qiagen公司的microRNAs RT-kit逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，應用熒光定量PCR定量PD組及對照組血清中Hsa-miR-205，hsa-miR-454的表達水平。
　　結(jié)果:本章研究利用qReal-Time PCR

21、對16例PD患者及20例健康對照者的血清中游離miR-205進行相對定量分析，PD患者血清中的miR-205表達較正常對照組低，應用T檢驗進行統(tǒng)計學分析，兩者差異的P值=0.0001，差異具有統(tǒng)計學意義;PD患者血清中的miR-454表達較正常對照組低，應用T檢驗進行統(tǒng)計學分析，兩者差異的P值=0.04，差異具有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)論:PD患者血清中游離miR-205水平較正常對照明顯減低，miR-205很可能為PD的生物標記物;