1、目的；構(gòu)建漢坦病毒(hantavirus，HV)莒南擴增株JUN05株核衣殼蛋白(nucleocapsidprotein，NP)的熒光蛋白表達載體；將HVNP基因與EGFP基因在BHK21細胞中融合表達，熒光顯微鏡下觀察融合蛋白的表達強度，以及融合蛋白在細胞中定位和分布，免疫組化觀察融合蛋白的免疫反應(yīng)性，從而為新型HV診斷試劑研制與開發(fā)，以及NP結(jié)構(gòu)與功能的研究奠定基礎(chǔ)。 方法；根據(jù)HV莒南擴增株JUN05株NP基因的序列和表達

2、載體pEGFP-N1的多克隆位點序列，設(shè)計引物，通過PCR的方法擴增NP全基因。PCR產(chǎn)物回收后以核酸內(nèi)切酶BglⅡ、PstⅠ雙酶切，克隆至同樣雙酶切的pEGFP-N1載體上，并保持NP基因與EGFP基因的讀碼框一致，CaCl2法轉(zhuǎn)化并篩選陽性克隆。通過PCR方法和雙酶切方法鑒定，并通過DNA測序技術(shù)最終鑒定表達載體的構(gòu)建情況。將重組質(zhì)粒以脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染BHK21細胞，轉(zhuǎn)染24h后固定細胞，熒光顯微鏡檢和免疫組化技術(shù)觀察融合蛋白的表達并拍

3、照記錄。 結(jié)果；1.構(gòu)建了含有HVNP基因的熒光蛋白表達載體，酶切鑒定、PCR鑒定、及測序結(jié)果表明載體構(gòu)建成功。 2.測序結(jié)果表明，NP基因成功連入EGFP基因上游，二者讀碼框一致無移位，與NP基因在克隆載體中的序列比對，無PCR擴增導(dǎo)致的堿基突變，并且NP基因末端的終止密碼子TAA被去除。并添加了kozak序列，為高效表達提供了基因水平的改造。 3.熒光顯微鏡下觀察，NP-EGFP融合蛋白在BHK21細胞中得到

4、高效表達，細胞漿內(nèi)充滿了致密的綠色熒光，熒光呈核周分布，達到了以綠色熒光蛋白作為報告基因觀察NP的表達及定位的目的。免疫組化也出現(xiàn)了陽性信號。 結(jié)論；本次研究利用基因工程技術(shù)成功地構(gòu)建了含有HV莒南擴增株JUN05株NP全長基因的表達載體pEGFP-NP。NP基因成功連入EGFP基因上游，使NP基因位于CMV啟動子之下，并添加了kozak序列，為高效表達提供了基因水平的改造。融合蛋白NP-EGFP基因在BHK21細胞中得到了高效