1、研究背景：再生障礙性貧血（aplastic anemia，AA，簡稱再障）發(fā)病機理較為復(fù)雜，近年研究認為與造血干細胞（hematopoietic stem cell，HSC）內(nèi)在增殖或分化缺陷，造血微循環(huán)系統(tǒng)異常及機體免疫功能紊亂有關(guān)，三種機制在不同個體單獨或聯(lián)合作用，導(dǎo)致造血功能衰竭。目前認為，AA是一種以造血系統(tǒng)為靶目標(biāo)的自身免疫性疾病，其中T細胞的功能異常發(fā)揮著關(guān)鍵作用。骨髓間充質(zhì)干細胞（bone marrow mesenchym

2、al stem cells，BMSCs）是來源于骨髓基質(zhì)的一類具有自我更新能力和具有免疫調(diào)節(jié)作用的干細胞，許多臨床研究報告指出，MSC可以治療一些自身免疫性疾病，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、硬皮病，移植物抗宿主病（GVHD）等。目前研究發(fā)現(xiàn)MSC調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的可能機制為：MSC具有獨特的免疫表型，不表達MHCII分子和FasL，不表達或極低表達MHCI分子，不表達共刺激分子B7-1，B7-2，CD40，CD40L，因此它具低免疫原性，很難被免疫系

3、統(tǒng)識別。體外實驗表明，MSC能抑制T細胞在混合淋巴細胞培養(yǎng)或有絲分裂刺激下的增殖。而在細胞免疫應(yīng)答時，環(huán)境中的可溶性外來抗原不能直接觸發(fā)T細胞的免疫應(yīng)答，是由抗原提呈細胞(antigen presenting cell，APC)以特定的方式呈遞給T細胞，而T細胞的激活和產(chǎn)生細胞因子與不同類型的APC相關(guān)。樹突狀細胞（dendritic cells，DCs）是目前已知體內(nèi)功能最強的專職性APC，能夠在體內(nèi)外直接刺激初始型T細胞（naive

4、 T cells）增殖。MSC對AA患者T細胞增殖的影響國內(nèi)僅見少量報道，而MSC是否通過調(diào)節(jié)DCs來影響AA患者T細胞的增殖，國內(nèi)未見報道，其機制值得深入研究。
　　 研究目的：（1）研究MSC是否對AA患者的T細胞具有抑制增殖作用；（2）探討MSC是否通過調(diào)節(jié)DCs的分化成熟來影響AA患者T細胞的增殖。
　　 研究內(nèi)容：（1）將正常人骨髓的MSC與AA患者的T細胞共培養(yǎng)，流式細胞儀檢測共培養(yǎng)前后的T細胞表面抗原和T細

5、胞亞群的變化，以及免疫相關(guān)的細胞因子IL-2，IL-4，IL-10，IFN-γ在培養(yǎng)前后表達的變化（ELISA法），研究MSC對AA患者的T細胞活化和增殖的影響。(2)從正常人外周血單個核細胞誘導(dǎo)DCs，將未成熟DCs在脂多糖（LPS）刺激下與正常人骨髓的MSC共培養(yǎng)，檢測有或無MSC共培養(yǎng)前后，流式細胞儀檢測DCs表面抗原和共刺激分子CD80和成熟標(biāo)記物抗原CD83的表達，研究MSC對DCs發(fā)育的影響。(3)將正常人外周血單個核細胞誘

6、導(dǎo)DCs，在LPS的刺激下獲成熟DCs后與正常人骨髓的MSC與共培養(yǎng)，DCs表面抗原和共刺激分子CD80和成熟標(biāo)記物抗原CD83的表達（流式細胞儀），研究MSC對成熟DCs的影響。
　　 研究方法：(l)體外分離培養(yǎng)正常人的MSC，觀察細胞形態(tài)，同時用流式細胞儀檢測其分子表面抗原CDl05，CD29，CD34，CD44，HLA-DR。(2)提取20例再障患者（未經(jīng)抗胸腺球蛋白等免疫治療）的外周血單個核細胞，用T淋巴細胞尼龍毛柱分

7、離法提取T淋巴細胞。用流式細胞儀進行T細胞表面抗原和T細胞亞群的檢測鑒定。（3）取健康人外周血，分離單個核細胞，在重組人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）和重組人白介素-4（IL-4）的培養(yǎng)條件下制備DCs。在LPS誘導(dǎo)下獲得成熟樹突細胞，用流式細胞儀進行DCs成熟前后的表型鑒定。（4）用正常人骨髓MSC與再障患者來源的T細胞共培養(yǎng)，流式細胞儀檢測T細胞亞群的變化，以及與免疫相關(guān)的細胞因子IL-2，IL-4、IFN-γ、IL-1

8、0的蛋白水平在共培養(yǎng)前后的表達 (ELISA法)。(5) 從正常人外周血單個核細胞誘導(dǎo)DCs，將未成熟DCs在LPS刺激下與正常人骨髓的MSC共培養(yǎng)，流式細胞儀檢測有或無MSC共培養(yǎng)前后，DCs表面抗原CD1a、共刺激分子CD80和成熟標(biāo)記物抗原CD83的表達。（6）將正常人外周血單個核細胞誘導(dǎo)DCs，在LPS的刺激下獲成熟DCs后與正常人骨髓的MSC與共培養(yǎng)，在顯微鏡下觀察細胞形態(tài)的變化，流式細胞儀檢測DCs表面抗原CD1a和共刺激分

9、子CD80和成熟標(biāo)記物抗原CD83的表達。
　　 研究結(jié)果：（1）正常骨髓間充質(zhì)干細胞與AA外周血T淋巴細胞共培養(yǎng)后，流式細胞儀檢測T細胞的CD8+細胞比例由（38.65士1.89）％下降為（29.69士1.62）％，CD4+細胞比例由（24.89士1.35）％上升至（34.89士1.89）％，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；ELISA檢測IL-2蛋白水平由(38.89士4.36) ng/L下降為（6.8士2.12）ng/L

10、；IFN-γ由（38.46士1.64）ng/L下降為（6.62士1.78）ng/L；IL-4由(2.8士0.86) ng/L上升為（5.32士1.68）ng/L；IL-10由（2.87士1.12）ng/L上升至（8.28士1.42）ng/L，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。（2）未成熟的DCs在LPS的刺激下誘導(dǎo)后，流式細胞儀檢測正常誘導(dǎo)組DCs細胞表面CD1a的表達升高，由誘導(dǎo)前的（2.4士1.2）％上調(diào)至（68.4士12.3）

11、％，而CD14+的表達由誘導(dǎo)前的（83.6士1.4）％下調(diào)至（3.5士1.2）％，CD83由（58.7士3.6）％上調(diào)至（72.4士10.6）％，CD80由（41.2士3.8）％上調(diào)至（50.6士6.2）％；而與MSC共培養(yǎng)組，CD1a表達率為（4.4士1.5）％，CD14+的表達仍保持較高的水平為（82.3士1.6）％，CD83表達為（60.8士12.2）％，CD80表達為（42.2士2.4）％，與LPS誘導(dǎo)前比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（

12、P>0.05）。（3）成熟DCs與MSC共培養(yǎng)后，CD14+由（5.8士2.0）％上調(diào)至(62.8士1.6)％，CD1a的表達率（48.6士4.2）％下調(diào)至（30.7士7.8）％，CD83由（60.8士12.2）％下調(diào)至（40.9士6.2）％，CD80由（50.2士4.8）％下調(diào)至（20.3士2.6）％，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。
　　 結(jié)論：MSC通過對CD8+和CD4+細胞的調(diào)節(jié)，抑制再障患者T淋巴細胞的增殖，進