1、鎘是一種廣泛存在的環(huán)境污染物,1993年國際癌癥研究機構(gòu)(IARC)已將其列為確切的人類致癌物(IA).有關(guān)鎘的致癌作用,近年來在分子水平上展開了廣泛的研究,涉及到DNA損傷、基因調(diào)節(jié)和細胞信號傳導、細胞凋亡等方面.越來越多的實驗表明誘導氧化損傷是鎘引起癌變和細胞毒性的一個重要機制.當給予Vit-C、Vit-E、GSH或GSH-Px等抗氧化劑,可有效拮抗鎘的致癌作用和細胞毒性.基于已有研究結(jié)果,推測在一定條件下,如果增加正常細胞中GST

2、-Pi的水平,有可能在對抗和消除鎘的致癌和細胞毒性中起重要作用.該研究第二部分的工作是從細胞水平探討轉(zhuǎn)導并表達GST-Pi基因后對鎘抑制細胞增殖作用的影響,為深入了解GST-Pi在腫瘤預(yù)防中的作用提供參考.研究方法:一、hGSTs GSTM1、T1、P1多態(tài)性基因型檢測與驗證 1、GSTM1、T1、P1多態(tài)性基因型的檢測:隨機抽取該課題組其它分題用PCR-RFLP技術(shù)檢測過的樣本提取基因組DNA,用雙重PCR判定GSTM1、T1是否為缺

3、失基因型;常規(guī)PCR擴增GSTP1基因,將檢測結(jié)果與先前檢測結(jié)果進行比較,同時選擇GSTM1、GSTT1非缺失基因型和GSTP1樣本用于T載體克隆及測序.2、T載體克隆及鑒定:目的基因與T載體連接后,轉(zhuǎn)導入感受態(tài)細胞DH5α擴增、提純質(zhì)粒.以質(zhì)粒DNA為模板,通過PCR擴增和限制性酶切鑒定T載體克隆是否成功.3、測序:將含有目的片段的質(zhì)粒DNA雙向測序,以鑒定目的片段是否插入T載體及確定其基因型.4、兩種方法學檢測結(jié)果比較:將該研究用P

4、CR擴增及T載體克隆、測序方法檢測結(jié)果與該課題組用PCR-RFLP檢測方法所得結(jié)果相比較,了解該課題組建立的基因多態(tài)性檢測反應(yīng)體系的準確性、可靠性及可重復性.二、GSTPi對鎘細胞毒性影響的買驗研究 1、鎘對NIH3T3細胞生長抑制作用研究:選擇NIH3T3細胞給予0.1625μmo1·L<'-1>~80μmol·L<'-1>的氯化鎘,采用噻唑蘭(MTT)顏色反應(yīng)法檢測6~24hrs的細胞增殖功能,了解鎘對NIH3T3細胞生長抑制作用的

5、劑量-效應(yīng)關(guān)系和時間-效應(yīng)關(guān)系,為進一步研究鎘對GSTPi表達的NIH3T3-Pi細胞生長抑制作用尋找染毒劑量等依據(jù).2、GSTPi cDNA綠色熒光蛋白真核表達載體構(gòu)建:提取人鼻咽癌細胞CNE1、CNE2總RNA,通過逆轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈式反應(yīng)擴增GSTPi基因cDNA全序列,經(jīng)T載體克隆后利用基因重組技術(shù)將該基因序列插入綠色熒光蛋白表達載體,構(gòu)建GSTPi cDNA綠色熒光蛋白真核表達載體,用于轉(zhuǎn)染細胞.3、GSTPi表達細胞建立:應(yīng)用

6、真核細胞轉(zhuǎn)染方法將GSTPi cDNA表達載體導入NIH3T3細胞,獲得GSTPi表達細胞.經(jīng)熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染細胞、免疫組化檢測GSTPi表達情況.4、GSTPi對鎘細胞毒性影響的研究:GSTPi表達細胞NIH3T3-Pi和GSTPi低表達細胞NIH3T3-N1給予0.1625μmol·L<'-1>~10μmol·L<'-1>鎘染毒,采用噻唑蘭(MTT)顏色反應(yīng)法檢測6hrs、12hrs的細胞增殖功能,了解鎘對GSTPi表達細胞生長抑