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文檔簡介
1、目的:(1)建立簡便、易行的新生大鼠海馬神經(jīng)干細胞(NSC)的分離培養(yǎng)和擴增的方法,并鑒定神經(jīng)干細胞;(2)探討神經(jīng)干細胞在體內(nèi)外增殖、分化的特點,并從局部微環(huán)境角度來探討神經(jīng)干細胞的發(fā)生與分化機制,為細胞體內(nèi)移植研究奠定基礎(chǔ)。 方法:(1)從新生大鼠海馬中分離NSC,采用NSC克隆懸浮法,選用DMEM/F12培養(yǎng)液,添加無血清培養(yǎng)添加劑B<,27>,堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)及表皮細胞生長因子(EGF)進行體外擴增培養(yǎng)
2、,機械和胰酶消化的方法分離連續(xù)傳代培養(yǎng),倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài),并采用免疫細胞化學(xué)法檢測NSC標志物Nestin的表達及分化后細胞神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)和2,3-環(huán)核甘酸磷酸二脂酶(CNP)的表達;(2)觀察20ng/ml濃度下的bFGF、EGF對NSC增殖的影響,用免疫熒光染色和流式細胞儀分選細胞法觀察bFGF,EGF對神經(jīng)干細胞分化為神經(jīng)元、星型膠質(zhì)細胞、少突膠質(zhì)細胞的影響;(3)采用化學(xué)法
3、、差速貼壁法和振蕩法分離純化星型膠質(zhì)細胞,用免疫細胞化學(xué)染色法,GFAP標記星型膠質(zhì)細胞,進行細胞純度的鑒定;將星型膠質(zhì)細胞接種在6孔培養(yǎng)板中,待細胞均勻長滿后,換神經(jīng)干細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)液,置于培養(yǎng)箱孵育24h,將涂有PLL的蓋玻片放入6孔板中,將神經(jīng)干細胞球種到蓋玻片上,在互不接觸的情況共培養(yǎng),每2d更換一次培養(yǎng)基,免疫細胞化學(xué)染色法觀察星型膠質(zhì)細胞源性因子對神經(jīng)干細胞分化后 NSE、GFAP和酪氨酸羥化酶(TH)表達的影響。 結(jié)
4、果: (1)從新生大鼠海馬分離的細胞在含有生長因子bFGF或EGF的無血清的神經(jīng)干細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)液中,能形成大量懸浮的神經(jīng)干細胞球,流式細胞儀的結(jié)果表明這些干細胞球可在體外擴增及傳代培養(yǎng),經(jīng)免疫細胞化學(xué)鑒定,Nestin抗體標記陽性,分化后的細胞表達神經(jīng)元、星型膠質(zhì)細胞、少突膠質(zhì)細胞的特異性抗原;(2)免疫熒光染色和流式細胞儀分選細胞顯示bEGF能明顯增加NSE的表達(P<0.05),EGF能明顯增加GFAP的表達(P<0.05);(3)
5、純化的星型膠質(zhì)細胞經(jīng)免疫細胞化學(xué)鑒定,GFAP抗體標記陽性,細胞純度達98%;(4)星型膠質(zhì)細胞與神經(jīng)干細胞共培養(yǎng)時,神經(jīng)干細胞貼壁分化加快,經(jīng)免疫組化染色鑒定,NSE陽性細胞及TH陽性細胞明顯多于對照組(P<0.05)。結(jié)論:(1)能夠從新生大鼠的海馬中分離出具有能自我更新、具有增殖能力和多分化潛能,表達Nestin蛋白的干細胞,該類細胞屬于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的干細胞,該方法簡便易行,是進行誘導(dǎo)分化的良好細胞模型;(2)bFGF誘導(dǎo)NSC更
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