1、目的：建立鼠角膜緣干細(xì)胞體外培養(yǎng)方法。了解全反式維甲酸(RA)對鼠角膜緣干細(xì)胞分化為神經(jīng)干細(xì)胞樣細(xì)胞的影響。探討體外誘導(dǎo)鼠角膜緣干細(xì)胞分化為神經(jīng)干細(xì)胞樣細(xì)胞的可行性。
　　方法：
　?。?）角膜緣干細(xì)胞分離、培養(yǎng)與鑒定：取大鼠角膜緣組織消化法進(jìn)行原代培養(yǎng)（基本培養(yǎng)基為20％FBS，80%DMEM/F12，PS100U/ml），倒置顯微鏡下觀察培養(yǎng)細(xì)胞的體外生長狀況，隔天半量換液且傳代，培養(yǎng)第七天（傳代培養(yǎng)第5天），免疫細(xì)胞化

2、學(xué)檢測角膜緣干細(xì)胞標(biāo)志物P63蛋白表達(dá)情況，鑒定角膜緣干細(xì)胞；
　?。?）角膜緣干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化：將原代細(xì)胞按誘導(dǎo)體系中誘導(dǎo)因素的不同分為3組，對照組：細(xì)胞培養(yǎng)液為基本培養(yǎng)基（20%FBS，80%DMEM/F12，PS100U/ml）；實(shí)驗(yàn)組1：在基本培養(yǎng)基中加入EGF(20ng/ml)，bFGF(10ng/ml)；實(shí)驗(yàn)組2：在基本培養(yǎng)基中加入EGF(20ng/ml)，bFGF(10ng/ml)，培養(yǎng)至第5天，再加入RA(25ng

3、/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)；三組均隔天半量換液且傳代，培養(yǎng)至第7天（實(shí)驗(yàn)組2加入RA48小時(shí)后），同時(shí)收集各組細(xì)胞作神經(jīng)元標(biāo)志物Nestin的免疫細(xì)胞化學(xué)檢測，陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)，相關(guān)數(shù)據(jù)作統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　結(jié)果：
　?。?）角膜緣干細(xì)胞分離、培養(yǎng)與鑒定：第三天可見細(xì)胞形成許多小集落，集落細(xì)胞呈圓球形；培養(yǎng)第七天（傳代培養(yǎng)第5天），細(xì)胞形成較大的集落，免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示：P63陽性細(xì)胞數(shù)量多，占細(xì)胞數(shù)的（82.19±5.32）%

4、。
　?。?）角膜緣干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化：分組誘導(dǎo)培養(yǎng)第7天，實(shí)驗(yàn)組1和實(shí)驗(yàn)組2培養(yǎng)細(xì)胞Nestin均呈陽性表達(dá)，陽性率分別為（77.01士6.32）%和（84.01士5.43）%，對照組培養(yǎng)細(xì)胞Nestin呈陰性表達(dá)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析證實(shí)，實(shí)驗(yàn)組2和實(shí)驗(yàn)組1相比，實(shí)驗(yàn)組2鼠角膜緣干細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為神經(jīng)干細(xì)胞樣細(xì)胞的比率高于實(shí)驗(yàn)組1。
　　結(jié)論：
　?。?）消化法適用于鼠角膜緣干細(xì)胞的體外培養(yǎng)。
　　（2）體外誘導(dǎo)鼠角膜緣干細(xì)