1、背景:
　　維生素D是一種具有廣泛生物效應的激素載體，它除了有調節(jié)鈣、磷代謝，調控細胞生長發(fā)育等作用之外，同時也與免疫調節(jié)密切相關。其功能主要是通過維生素D3受體（Vitamin D receptor，VDR）來介導，VDR為親核蛋白，屬于類固醇激素/甲狀腺受體超家族的成員。VDR與1，25(OH)2D3結合形成VDR/RXR，該復合物可與靶基因上游啟動子區(qū)或調控區(qū)域上的特定DNA序列相結合，進而對靶基因的轉錄表達進行調控。

2、>　　VDR參與鈣離子代謝、骨骼形成、細胞生長分化、腫瘤抑制、免疫調節(jié)等各個環(huán)節(jié)，與病原微生物感染密切相關的靶基因cathelicidin antimicrobial peptides(CAMP)的活化具有密切的相關性。CAMP除了具有抗菌活性外，還具有免疫調節(jié)、抑制組織損傷、促進創(chuàng)傷修復等功能，是宿主防御系統(tǒng)的重要成分。
　　作為一類重要的轉錄因子，VDR是否對H.pylori感染具有免疫保護作用目前尚未見文獻報道。目前認為VD

3、R在抗感染免疫中起重要作用，可能與清除微生物感染和減輕組織損傷相關。進一步研究VDR對細菌感染的免疫保護效果及其誘導的炎癥和免疫信號通路在抗感染過程中的作用具有重要意義。
　　方法:
　　1)收集門診病人胃黏膜標本:胃鏡下活檢胃黏膜標本兩份，一份送病理，一份液氮保存。
　　2)H.pylori感染胃黏膜上皮細胞:胃黏膜上皮細胞GES-1鋪板培養(yǎng)24h之后，以不同的MOI值(MOI=0，10，50，100)與H.pylo

4、ri共培養(yǎng)24h或以MOI值為100分別共培養(yǎng)0h，6h，12h，24h。
　　3) siVDR轉染胃黏膜上皮細胞:轉染前一天，在不包含抗生素的RPMI培養(yǎng)基中接種細胞，轉染時細胞的匯合度要達到30～50％。應用脂質體LipofectamineTM2000作為轉染試劑，以脂質體轉染法將雙鏈siRNA導入到GES-1細胞。設立陰性對照組(轉染無敲低效果的VDR-negative siRNA)，實驗組(分別轉染3對VDR siRNA)

5、。
　　4) RT-qPCR檢測:抽提組織或細胞Total RNA，檢測RNA濃度和純度，將RNA逆轉錄成cDNA，采用SYBR Green定量PCR試劑檢測VDR、CAMP、IL-6、IL-8、CYP24A1、DEFB4mRNA的表達情況，以GAPDH作為內參分析基因表達水平。
　　5) Western-Blot檢測:采用Lysis buffer抽提蛋白，應用Bradford法檢測蛋白濃度，蛋白變性后上樣至泳道進行SDS-

6、PAGE電泳，然后將蛋白轉移到PVDF膜上，封閉1h，一抗4℃孵育過夜，再用HRP標記的二抗孵育1h，ECL化學發(fā)光后顯影、定影，最后用凝膠成像系統(tǒng)拍照。
　　6) ELISA檢測:吸取12孔培養(yǎng)板上的培養(yǎng)基，5000g/min離心后，獲得的上清液按照一定比例稀釋，按照試劑說明書檢測梯度稀釋的標準品以及樣本炎癥因子的濃度。
　　7)細菌活力檢測:GES-1細胞轉染siVDR、siCAMP或1，25(OH)2D3干預48h，然

7、后加MOI為100的H.pylori共培養(yǎng)2h，將細胞裂解倍比稀釋，以500ul稀釋液劃線涂板，培養(yǎng)3-5天后菌落計數(shù)。
　　8)統(tǒng)計分析:數(shù)據統(tǒng)計均用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，用SPSS16.0統(tǒng)計軟件包進行資料的t檢驗、方差分析以及Person's相關分析，P＜0.05表示差別具有統(tǒng)計學意義。
　　結果:
　　1)組織水平H.pylori感染對mRNA表達水平的影響:H.pylori感染組與正常對照組比較

8、VDR、CAMP、IL-6、IL-8均表達上調，VDR mRNA水平與慢性炎癥程度呈正相關的關系(r=0.536，P＜0.001)，CAMP與VDR mRNA表達水平呈正相關(r=0.814，P＜0.001)。
　　2)細胞感染H.pylori對VDR、CAMP表達的影響:RT-qPCR及Western-Blot結果顯示H.pylori感染組與對照組相比VDR、CAMP表達水平升高，并且具有時間和MOI值依賴性。
　　3)敲

9、低VDR基因對下游基因CAMP以及炎癥因子的影響:VDR敲低之后，下游基因CAMP表達水平下調，DEFB4以及CYP24A1表達下調，炎癥因子IL-6、IL-8升高。
　　4)VDR激動劑1，25(OH)2D3在H.pylori感染中的作用:1，25(OH)2D3導致GES-1細胞炎癥因子IL-6、IL-8表達下調，抗菌肽CAMP、防御素DEFB4、CYP24A1表達升高。
　　5) siVDR、siCAMP以及1，25(O

10、H)2D3對H.pylori活力的影響:siVDR、siCAMP使GES-1抗菌活力下降，細胞內活菌數(shù)量增加，而1，25(OH)2D3降低活菌數(shù)量。
　　結論:
　　1)組織、細胞水平驗證H.pylori感染導致VDR、CAMP、IL-6、IL-8表達上調;
　　2)VDR聯(lián)合激動劑1，25(OH)2D3具有調控下游基因抗菌肽CAMP、防御素DEFB4及CYP24A1的作用;VDR聯(lián)合激動劑1，25(OH)2D3具有調