1、目的 惡性實(shí)體腫瘤中心乏氧區(qū)腫瘤細(xì)胞對放療、化療的耐受性是導(dǎo)致治療失敗的重要原因之一.該研究擬構(gòu)建一種由缺氧反應(yīng)元件(hypoxia responsive element,HRE)調(diào)控的單純皰疹病毒胸苷激酶(herpes simplex virus-thymidine kinase,HSV-TK)基因的真核表達(dá)載體,觀察HRE能否增強(qiáng)HSV-TK/丙氧鳥苷(gancyclovir,GCV)系統(tǒng)對乏氧環(huán)境中的人Ewing肉瘤細(xì)胞系(SK-

2、ES-1細(xì)胞)的殺傷作用,為彌補(bǔ)放、化療的不足探索有效的治療方法.方法1 將化學(xué)法合成的HRE片斷,插入到空載體(pIRES<,2>-EGFP)的雙順反子熒光蛋白報告基因的真核啟動子的增強(qiáng)子部位,按插入片斷上下游載體序列合成引物1、2,以PCR方法篩選含HRE片斷的陽性克隆,測定鑒定,獲得重組質(zhì)粒pHRE;用引物3、4,以PCR法擴(kuò)增TK基因片斷,將其克隆到pIRES<,2>-EGFP及pHRE的雙順反子熒光蛋白報告基因上游的多克隆位點(diǎn)

3、,用PCR篩選含單拷貝正向插入TK片段的陽性克隆,測序鑒定,獲得重組質(zhì)粒pTK及pHRE-TK.2 用陽離子脂質(zhì)體將pHRE-TK、pHRE、pTK及pIRES<,2>-EGFP導(dǎo)入SK-ES-1細(xì)胞,分別在乏氧(O<,2>逍度為3﹪)和富氧(O<,2>濃度為21﹪)環(huán)境中培養(yǎng)16小時,熒光顯微鏡觀察報告基因增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)表達(dá)變化,進(jìn)行熒光光密度分析;