1、肥胖已成為全球性的一種慢性流行病,肥胖及其并發(fā)癥已成為現(xiàn)代社會(huì)的沉重負(fù)擔(dān).減肥藥物的研究與開發(fā)已成為各大制藥公司優(yōu)先考慮的一個(gè)重要目標(biāo).Leptin的發(fā)現(xiàn)揭示了體暈控制的分子機(jī)制.但由于大多數(shù)患者都對(duì)leptin耐受,使得leptin不能成為一個(gè)有效的治療肥胖癥的藥物.睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(ciliary neurotrophic factor,CNTF)是一種天然的leptin的"模擬物",可通過其特異性受體激發(fā)與leptin相似的信號(hào)轉(zhuǎn)

2、導(dǎo)通路,從而有效地繞過leptin耐受.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究都顯示了CNTF在治療肥胖癥上的良好的應(yīng)用前景.Regeneron公司發(fā)明的hCNTF的三重突變體AX15已完成肥胖癥的Ⅲ期臨床實(shí)驗(yàn),并取得了統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有顯著性差異的結(jié)果.但AX15分子的一些缺陷如易被蛋白酶降解,易聚合,較強(qiáng)的免疫原性和較短的半衰期等使其在成為藥物上遇到了障礙.該研究擬針對(duì)上述缺陷對(duì)AX15進(jìn)行改造.通過N-端氨基酸測序確定了AX15在巴斯德畢赤酵母中表達(dá)時(shí)的降

3、解位點(diǎn),并利用定點(diǎn)突變技術(shù)構(gòu)建了蛋白酶抗性突變體AX15(R13K).AX15(R13K)的穩(wěn)定性得到了顯著的提高,在搖瓶中誘導(dǎo)120小時(shí)后也未發(fā)生降解.雖然能被有效的分泌,AX15(R13K)在上清中以分子量為數(shù)十萬以上的聚集體形式存在.6M鹽酸胍可使AX15(R13K)聚集體解聚,利用Superdex75凝膠過濾層析可同時(shí)完成蛋白的復(fù)性和純化.體外的TF-1存活實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)減肥實(shí)驗(yàn)都表明AX15(R13K)具有與AX15相當(dāng)?shù)纳飳W(xué)活

4、性.蛋白酶抗性人睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子突變體可能具有更好的體內(nèi)穩(wěn)定性,在臨床應(yīng)用上具有潛在的優(yōu)勢.利用家族性DNA改組技術(shù)構(gòu)建了人-大鼠嵌合CNTF分子文庫.將AX15中Q63R突變及DH-CNTF中的S166D/Q167H突變組合在一起,構(gòu)建了DH-AX15(R13K)突變體.體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明了DH-AX15(R13K)的活性約是AX15(R13K)的5倍.在人CNTF分子表面由第44位L,第83位F,第85位V,第86位L,第98位F,

5、第151位L,第152位F,第156位L,第157位W和第159位L組成一個(gè)主要疏水區(qū)域.為了用親水性的糖鏈覆蓋該區(qū)域,防止CNTF突變體由疏水作用引起的聚合,在AX15(R13K)的第36,39,40,152,159位引入了糖基化位點(diǎn),構(gòu)建了5個(gè)糖基化突變體.在5個(gè)突變體中N36-AX15(R13K),N40-AX15(R13K),N159-AX15(R13K)等未能得到表達(dá),N152-AX15(R13K)雖然能表達(dá)但未發(fā)生糖基化,只