1、第一部分 CRISPLD2蛋白對(duì)HMGB1誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的影響及治療膿毒癥小鼠的效果
　　目的:探索CRISPLD2蛋白對(duì)HMGB1誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的影響及對(duì)膿毒癥小鼠血清炎癥因子水平的影響。探索CRISPLD2蛋白是否影響膿毒癥小鼠生存率。
　　方法:使用不同濃度的HMGB1蛋白刺激THP-1細(xì)胞，于0h、1h、3h、6h、12h、24h檢測(cè)THP-1細(xì)胞內(nèi)CRISPLD2蛋白的表達(dá)。篩選對(duì)CRISPLD2蛋白干擾效率最高的

2、小干擾RNA(siRNA)轉(zhuǎn)染THP-1細(xì)胞，在敲低內(nèi)源性CRISPLD2蛋白后使用HMGB1刺激THP-1細(xì)胞，檢測(cè)THP-1細(xì)胞內(nèi)炎癥因子和趨化因子轉(zhuǎn)錄的情況。使用HMGB1刺激THP-1細(xì)胞同時(shí)加入外源性重組CRISPLD2蛋白，檢測(cè)CRISPLD2蛋白對(duì)THP-1細(xì)胞內(nèi)炎癥因子和趨化因子轉(zhuǎn)錄的影響。給予膿毒癥小鼠靜脈注射重組CRISPLD2蛋白，24h后檢測(cè)血清炎癥因子水平，并記錄注射CRISPLD2蛋白后膿毒癥小鼠的10d生存

3、曲線。
　　結(jié)果:HMGB1可呈劑量依賴性和時(shí)間依賴性刺激THP-1內(nèi)CRISPLD2蛋白的表達(dá)。敲低THP-1細(xì)胞中內(nèi)源性CRISPLD2蛋白可增加HMGB1誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞內(nèi)炎癥因子（TNF-a、IL-6）和趨化因子(MCP-1、IL-8)的轉(zhuǎn)錄。加入外源性重組CRISPLD2蛋白可部分逆轉(zhuǎn)HMGB1誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞內(nèi)炎癥因子和趨化因子的轉(zhuǎn)錄。靜脈注射CRISPLD2蛋白可降低膿毒癥小鼠血清炎癥因子水平，但不能延長(zhǎng)膿毒

4、癥小鼠生存時(shí)間。
　　結(jié)論:CRISPLD2蛋白可以減輕HMGB1誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，降低膿毒癥小鼠血清炎癥因子水平，但不能提高膿毒癥小鼠生存率。
　　第二部分 CRISPLD2-anti-HMGB1雙功能融合蛋白的合成及功能鑒定
　　目的:設(shè)計(jì)并合成雙功能融合蛋白CRISPLD2-anti-HMGB1，確定其與LPS和HMGB1的親和力及熱平衡解離常數(shù)Kd(M)值。
　　方法:利用基因工程技術(shù)將CRISPLD2蛋白

5、共價(jià)連接于anti-HMGB1抗體Fc段，形成CRISPLD2-anti-HMGB1雙功能融合蛋白。使用考馬斯亮藍(lán)和PAGE電泳鑒定目的蛋白。利用BiaCORE技術(shù)測(cè)定雙功能融合蛋白CRISPLD2-anti-HMGB1與LPS和HMGB1的親和力及熱平衡解離常數(shù)Kd(M)值。競(jìng)爭(zhēng)性ELISA技術(shù)測(cè)定該融合蛋白與LPS和HMGB1的相互作用及競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抑制曲線。
　　結(jié)果:雙功能融合蛋白CRISPLD2-anti-HMGB1大小約2

6、50kD，其與LPS結(jié)合的親和力與天然CRISPLD2與LPS的親和力類似，Kd(M)值為（3.11±0.21）*10-6，其與HMGB1結(jié)合的親和力與anti-HMGB1類似，Kd(M)值為(2.02±0.68)*10-10。在競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合抑制實(shí)驗(yàn)中，該融合蛋白對(duì)LPS和HMGB1的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合抑制曲線與天然CRISPLD2和anti-HMGB1的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合抑制曲線相似。
　　結(jié)論:雙功能融合蛋白CRISPLD2-anti-HMGB

7、1可與LPS和HMGB1結(jié)合，且親和力較高。
　　第三部分 CRISPLD2-anti-HMGB1雙功能融合蛋白對(duì)炎癥反應(yīng)的影響及治療膿毒癥小鼠的效果
　　目的:探索雙功能融合蛋白CRISPLD2-anti-HMGB1的體內(nèi)代謝動(dòng)力學(xué)。探索該融合蛋白對(duì)炎癥因子表達(dá)、炎癥通路激活的影響。探索該融合蛋白對(duì)膿毒癥小鼠器官功能的保護(hù)作用和生存率的影響。
　　方法:予小鼠注射50mg/kg的CRISPLD2-anti-HMGB1

8、雙功能融合蛋白，于注射后1h，1d，3d，7d，10d，14d取靜脈血測(cè)定該融合蛋白濃度。使用LPS(0.1ng/ml)和HMGB1(0.1 ug/ml)的混合液分別與CRISPLD2蛋白、anti-HMGB1、CRISPLD2-anti-HMGB1共孵育后再刺激THP-1細(xì)胞，檢測(cè)各組炎癥因子和趨化因子的轉(zhuǎn)錄情況，炎癥通路NF-kB和MAPK中p-p65、p-p38、p-pJNK1/2、p-pERK1/2的表達(dá)情況。分別予膿毒癥小鼠注

9、射治療劑量的CRISPLD2蛋白、anti-HMGB1、CRISPLD2-anti-HMGB1，24h后檢測(cè)小鼠血清炎癥因子水平，肺組織病理變化，記錄10d生存曲線。
　　結(jié)果:CRISPLD2-anti-HMGB1雙功能融合蛋白的體內(nèi)半衰期約為4d。在體外，該融合蛋白可降低LPS和HMGB1混合液誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞內(nèi)炎癥因子（TNF-a、IL-6）和趨化因子(MCP-1、IL-8)的轉(zhuǎn)錄及炎癥通路中p-p65、p-p38、p-