1、目的 觀察骨質疏松性骨折愈合的病理特點，研究L-arginine對骨質疏松性骨折愈合的影響，并探討其作用機制。 方法 1．采用酶消化法分離培養(yǎng)得到大鼠成骨細胞，經鑒定證實為成骨細胞后，在其培養(yǎng)液中加入不同濃度的L一arginine和PTH后，應用MTT法測定成骨細胞增殖率的變化，蛋白印跡分析成骨細胞OPG蛋白的表達情況，免疫組化法分析對成骨細胞中eNOS及iNOS的影響。 2．采用骨髓誘導法分離培養(yǎng)得到大

2、鼠破骨細胞，經鑒定證實為破骨細胞后，在其培養(yǎng)液中加入不同濃度的L-arginine后，相差顯微鏡觀察連續(xù)觀察破骨細胞數目和形態(tài)的變化，將TRAP染色后的細胞進行TRAP陽性細胞觀察與計數，并對骨磨片上的骨吸收陷窩進行定量分析。 3．應用去卵巢低鈣飲食大鼠于術后3個月證實發(fā)生骨質疏松后，于左側股骨中段制作骨質疏松性骨折模型，分別于術后1周，2周，4周，8周和12周，X線觀察骨折愈合大體情況，雙能X線骨密度儀檢測左側股骨BMD的變化

3、，組織學檢測骨質疏松性骨折愈合情況，應用免疫組化法測定骨折愈合過程中eNOS及iNOS的表達，檢測血清生化指標的變化，并均與正常骨折愈合過程進行對照。 4．對骨質疏松性骨折模型大鼠分別給予12周的不同藥物：L-arginine，易維特，rhPTH<,l-34>，密鈣息，福善美，同時給予骨質疏松模型組大鼠和假手術組大鼠等體積的生理鹽水，分別于治療后1周，2周，4周，8周和12周進行x線，BMD，組織學和血清生化指標檢測。

4、 結果 1．培養(yǎng)得到的大鼠成骨細胞具有典型形態(tài)結構，堿性磷酸酶染色陽性細胞數超過90％，可形成鈣結節(jié)。MTT試驗各組隨培養(yǎng)時間的延長成骨細胞OD值均增加，當培養(yǎng)液中含PTH為10<'-6>mol／L或L-arginine為0.6 g／L時，均較其余實驗組明顯增加成骨細胞OD值。Western雜交分析表明，成骨細胞可以分泌OPG蛋白，試驗濃度的L-arginine和PTH均促進了OPG蛋白的表達，尤以PTH濃度為10<'-6>m

5、ol／L或L-arginine濃度為0.6 g／L最為顯著。免疫組化分析成骨細胞中eNOS及iNOS的表達發(fā)現，同一濃度的L-arginine促進成骨細胞表達iNOS的陽性細胞數較eNOS的陽性細胞更多；當L-arginine濃度為0.6g／L時，成骨細胞表達iNOS及eNOS的陽性細胞數最多。 2．經骨髓誘導方法得到的破骨細胞具有典型的破骨細胞形態(tài)結構，特異性酶染色-TRAP染色證實所培養(yǎng)的細胞是破骨細胞，且能在骨片上形成典型

6、的骨吸收陷窩，具有骨吸收功能。當培養(yǎng)液中加入不同實驗濃度的L-arginine后，隨L-arginine濃度的升高TRAP陽性細胞逐漸減少，骨吸收陷窩數目均顯著減少，并且骨吸收陷窩面積和數目均隨培養(yǎng)液中L-arginine濃度的升高而下降。 3．對去卵巢大鼠飼以低鈣飼料，3個月后證實發(fā)生骨質疏松后，再行左側股骨中段骨折制作骨質疏松性骨折動物模型。于術后1周，2周，4周，8周和12周，檢測左側股骨BMD值，隨時間延長其左側股骨BM

7、D值呈升高趨勢，OPF組大鼠左側股骨BMD在實驗的各個時期均較SOF組均顯著降低。經x線觀察和組織學檢測發(fā)現，OPF組大鼠骨痂生成相對較少，軟骨化成骨過程滯后；新生骨小梁粗細不均且排列紊亂，與主應力方向不一致，連續(xù)性較差；骨小梁周邊成骨細胞和骨細胞較SO組少，但破骨細胞數量增多，骨吸收活動活躍，骨轉換率較快。骨質疏松性骨折愈合不同階段可見iNOS和eNOS表達陽性的細胞。iNOS在成纖維細胞、成軟骨細胞和血管內膜表達，eNOS主要在骨折

8、處增生的血管內膜表達；iNOS和eNOS分別于骨折后1周和2周處在其表達高峰。血清生化指標檢測表明，兩組實驗動物血清ALP在各時間段差異均無統(tǒng)計學意義。OPF組大鼠骨折術后1周時直到實驗結束，血清BAP和CTX水平始終維持在高水平，且與SOF組相比差異有統(tǒng)計學意義；術后12周時，OPF組大鼠血清NO水平和雌激素水平均較SOF組大鼠顯著下降。 4．對骨質疏松性骨折模型大鼠分別給予不同藥物：L-arginine，易維特，rhPTH<

9、,1-34>，密鈣息，福善美，于藥物治療后l周，2周，4周，8周和12周，檢測左側股骨BMD值，各組實驗動物左側股骨BMD值呈增高趨勢，與骨質疏松性骨折模型組大鼠相比前4周各時間段左側股骨BMD值差異均無統(tǒng)計學意義，至治療后8周時差異有統(tǒng)計學意義。X線觀察和組織學檢測發(fā)現，L-arginine，易維特，密鈣息，福善美等骨吸收抑制劑，可以促進骨質疏松性骨折愈合早期的間充質細胞、成纖維細胞；粒細胞、單核．巨噬細胞等細胞聚集，毛細血管增生，纖

10、維骨痂形成增多；新生骨小梁明顯增粗，連續(xù)性好，排列較緊密有序。骨折愈合晚期減少破骨細胞數量，抑制破骨細胞骨吸收；至藥物治療12周后，骨折基本骨性愈合，髓腔再通，骨重建較好。PTH可以在骨質疏松性骨折愈合早期促進血腫機化，纖維骨痂形成增多；增強成骨細胞數量和成骨細胞功能活性，骨量增加明顯，新生骨小梁排列較緊密，有序，骨小梁表面破骨細胞數量多，破骨細胞吸收明顯；至治療12周后，骨折基本骨性愈合，髓腔再通，外骨痂較多，骨重建現象活躍。骨質疏松

11、性骨折大鼠經L-arginine，易維特，密鈣息和福善美藥物治療后，血清BAP和CTX水平呈下降趨勢，且在4周后與骨質疏松性骨折模型組相比明顯下降，而福善美組實驗動物血清CTX水平于治療后2周即較對照組明顯下降；rhPTH<,1-34>組大鼠血清BAP水平呈升高趨勢，4周后明顯高于對照組組血清BAP水平，血清CTX水平無明顯變化，與對照組相比無統(tǒng)計學差異；各組實驗動物于藥物治療后12周時，血清NO水平均較對照組大鼠顯著升高。 結

12、論 1．實驗證明PTH和L-argnine均明顯促進成骨細胞分裂增殖，提高成骨細胞功能活性。而當PTH為10<'-6>mol／L或L-arginine為0.6 g／L時，是利于成骨細胞分裂生長的最佳濃度，且促進成骨細胞OPG的表達量最大。當L-arginine濃度為0.6g／L時，成骨細胞表達iNOS及eNOS的陽性細胞數最多，由此進一步說明L-arginine濃度為0.6g／L是促進成骨細胞功能的最佳濃度。 2．采用骨

13、髓誘導方法培養(yǎng)得到的破骨細胞數量較多，純度較高，且具有明顯的骨吸收功能。不同濃度的L-arginine加入破骨細胞體外培養(yǎng)體系后，經TRAP陽性細胞觀察計數和骨吸收陷窩定量分析后，發(fā)現0.3g／L的L-atginine即明顯抑制破骨細胞的形成，并降低破骨細胞骨吸收功能，隨著L-arginine濃度的升高，這種抑制破骨細胞的作用更加明顯。 3．通過成功建立骨質疏松性股骨中段骨折發(fā)現去卵巢大鼠出現骨質疏松后明顯影響骨折愈合，骨折后早

14、期骨折斷端的成骨細胞形成減少，血腫機化延遲；骨折愈合的中晚期軟骨性骨痂生成量增多，但向骨性骨痂演變過程延緩，破骨細胞骨吸收活躍，骨礦物沉積減少，骨痂質量下降，骨質疏松性骨折愈合明顯延遲，對臨床具有明顯重要的指導意義。 NOS在骨質疏松性骨折愈合的不同時期表達具有類型特異性和時間依賴性。iNOS和eNOS在骨質疏松性骨折愈合的不同時期，它們表達的強弱也有所不同。 血清BAP和CTX的變化可以早期反映骨質疏松性骨折骨代謝變化

15、的特點，具有簡便易行，靈敏度高等特點。通過測量血清BAP和CTX的水平，可以判斷骨質疏松性骨折時骨重建情況，監(jiān)測骨質疏松性骨折的治療。 4．實驗研究首次證明L-arginine促進骨質疏松性骨折愈合早期的炎癥細胞聚集，毛細血管增生，血腫機化；新生骨小梁明顯增粗，連續(xù)性好，排列較緊密有序，增加骨量。骨折愈合晚期減少破骨細胞數量，抑制破骨細胞骨吸收，使骨重建平衡，加速骨質疏松性骨折的愈合，提高骨折愈合質量。L-arginine促進骨