拉伸應(yīng)變對小鼠MLO-Y4細胞增殖的影響及作用機制研究.pdf_第1頁
已閱讀1頁,還剩62頁未讀, 繼續(xù)免費閱讀

下載本文檔

版權(quán)說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請進行舉報或認領(lǐng)

文檔簡介

1、目的:骨細胞作為骨組織中機械應(yīng)力的直接感受器,對維持骨組織的正常功能非常重要。但是應(yīng)力作用下骨細胞的分子生物學(xué)機制還不是十分清楚。本文擬研究不同周期和不同時間的拉伸應(yīng)變對小鼠MLO-Y4細胞Ca2+及其信號通路的影響,進而探討拉伸應(yīng)力對骨細胞的部分作用機制。為進一步研究骨重建機制提供科學(xué)理論和實驗依據(jù)。
   方法:
   1、研究選用小鼠骨細胞系MLO-Y4細胞作為研究對象,采用四點彎曲拉伸裝置對小鼠骨細胞分別施加應(yīng)力

2、為:2500με、5000με,頻率為0.5Hz,時間:1次/d、1h/次、連續(xù)拉伸3d。同時設(shè)有加入鈣離子抑制劑維拉帕米組(Verapamil)及U73122組,另設(shè)0με做為對照組。實驗分為:0με(control group)、2500με、5000με、V+2500με、V+5000με、U73122+2500με、U73122+5000με七組。采用MTT實驗檢測細胞增殖活性,探討拉伸應(yīng)變對MLO-Y4細胞增殖活性的影響。

3、r>   2、研究選用小鼠骨細胞系MLO-Y4細胞作為研究對象,采用四點彎曲拉伸裝置對小鼠骨細胞分別施加頻率為0.5Hz,應(yīng)力分別為:2500με、5000με,不同時間(1min、3 min、5 min、10 min)的拉伸應(yīng)變,另設(shè)0με(controlgroup)做為對照組,采用熒光分光光度法檢測各組細胞的熒光強度值,探討基底拉伸應(yīng)變對細胞內(nèi)游離鈣離子濃度([Ca2+]i)的影響。
   3、給MLO-Y4細胞施加頻率0

4、.5Hz,應(yīng)力分別為:2500με、5000με,實驗分為:0με(control group)、2500με、5000με、V+2500με、V+5000με、U73122+2500με、U73122+5000με七組,采用熒光標(biāo)記技術(shù)觀察2500με、5000με作用下CaM在MLO-Y4細胞的表達;采用熒光分光光度法檢測各組細胞的熒光強度值,檢測不同應(yīng)力下CaM的變化;采用Western-blot技術(shù)檢測CaMKⅡβ、CREB、p

5、-CREB的蛋白表達,探討拉伸應(yīng)力對Ca2+-CaM-CaMKⅡβ-CREB信號通路的影響。
   結(jié)果:
   1、拉伸應(yīng)變對小鼠MLO-Y4細胞增殖的影響。結(jié)果顯示:給MLO-Y4細胞施加2500με,頻率為0.5Hz,時間:1次/d、1h/次、連續(xù)拉伸3d,細胞增殖活性與對照組相比顯著增加(p<0.01);施加5000με,時間與頻率不變,細胞增殖活性與對照組相比顯著降低(p<0.05)。
   2、拉伸應(yīng)

6、變對小鼠MLO-Y4細胞[Ca2+]i的影響。研究結(jié)果證實:給MLO-Y4細胞施加2500με,頻率為0.5Hz,拉伸時間分別為:1min、3min、5min,各組[Ca2+]i與對照組(454.5175±31.3695)相比顯著升高(p<0.01),其中5min組拉伸(566.8609±26.3508)達最高值;當(dāng)MLO-Y4細胞施加5000με,頻率為0.5Hz,拉伸3min(253.2509±30.0641)其[Ca2+]i與對照

7、組相比顯著降低(p<0.01),1min、3min、5min、10min各組與對照組相比[Ca2+]i均呈下降趨勢,其變化趨勢與2500με相似,均在作用3min、10min時處于低點。
   3、拉伸應(yīng)變對小鼠MLO-Y4細胞CaM表達及活性的影響。結(jié)果顯示:MLO-Y4細胞有CaM的表達;給MLO-Y4細胞分別施加2500με、5000με,頻率為0.5Hz,拉伸時間和周期為1次/d,每次1h,連續(xù)3d,2500με作用下C

8、aM活性(399.3518±27.1691)較對照組(237.9961±20.0063)相比顯著升高(p<0.01),給予鈣通道阻滯劑Verapamil及磷脂酶C(PLC)抑制劑U73122后,CaM活性與2500με組相比均顯著下調(diào)(p<0.01);5000με作用下與對照組相比CaM活性顯著下降p<0.05);給予Verapamil及U73122后, CaM活性與5000με組相比均顯著下調(diào)(p<0.01)。
   4、拉伸

9、應(yīng)變對小鼠MLO-Y4細胞CaMKⅡβ蛋白表達的影響。Western-blot結(jié)果顯示:MLO-Y4細胞施加2500με,頻率及拉伸周期同前,CaMKⅡβ蛋白表達(13.7039±0.6881)較對照組(9.0573±0.4183)相比顯著升高(p<0.01),加入Verapamil和U73122,CaMKⅡβ蛋白表達均下調(diào)(p<0.01);當(dāng)細胞施加5000με時,CaMKⅡβ蛋白表達(10.6232±0.6119)與對照組相比顯著降

10、低(p<0.05),加入Verapamil,U73122,CaMKⅡβ蛋白與未加入拮抗劑組相比,表達進一步下調(diào)(p<0.01)。
   5、拉伸應(yīng)變對小鼠MLO-Y4細胞CREB和p-CREB蛋白表達影響結(jié)果顯示:細胞施加2500με、5000με時, CREB蛋白表達與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p>0.05);加入抑制劑Verapamil和U73122后,2500με、5000με組CREB蛋白表達仍無顯著變化(p>0.05

11、)。相同拉伸頻率、拉伸時間、2500με組(19.9547±1.5397) p-CREB蛋白表達與對照組(15.2538±1.1189)相比較顯著升高(p<0.01),加入抑制劑Verapamil(p<0.01)和U73122(p<0.05)較2500με組p-CREB蛋白表達均進一步下調(diào);相同條件拉伸5000με與加入抑制劑組比較,抑制劑組蛋白表達也顯著下調(diào)(p<0.05)。
   結(jié)論:本研究從細胞內(nèi)[Ca2+]i、CaM、

12、CaMK、CREB四個環(huán)節(jié)系統(tǒng)研究了拉伸應(yīng)變對小鼠MLO-Y4細胞增殖的影響及作用機制研究,發(fā)現(xiàn)拉伸應(yīng)變可以通過[Ca2+]i-CaM-CaMK-pCREB信號通路調(diào)控小鼠骨細胞的增殖。
   1、通過MTT實驗證實:生理載荷的拉伸應(yīng)變可以促進骨細胞增殖,超生理載荷拉伸應(yīng)變可以抑制骨細胞增殖,細胞內(nèi)鈣及外鈣均參與此過程。
   2、本實驗證實:向骨細胞分別施以0.5Hz,2500με、5000με拉伸應(yīng)力,作用1min、

13、3 min、5min、10min時均發(fā)生相應(yīng)的變化,但變化趨勢不同;當(dāng)細胞施加頻率為0.5Hz、2500με作用1min、5min時[Ca2+]i呈上升趨勢,5min時[Ca2+]i達到最高,3min、10min呈下降趨勢,施加5000με0.5Hz作用1 min、3min、5min、10min[Ca2+]i均下降,3min達到最低點。
   3、生理載荷的拉伸應(yīng)變可以促進CaM活性增強,超生理載荷拉伸應(yīng)變可以抑制CaM活性,內(nèi)

溫馨提示

  • 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
  • 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
  • 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會有圖紙預(yù)覽,若沒有圖紙預(yù)覽就沒有圖紙。
  • 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
  • 5. 眾賞文庫僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護處理,對用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內(nèi)容負責(zé)。
  • 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當(dāng)內(nèi)容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
  • 7. 本站不保證下載資源的準(zhǔn)確性、安全性和完整性, 同時也不承擔(dān)用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。

最新文檔

評論

0/150

提交評論