1、研究背景：
　　 糖酵解能力增強(qiáng)是腫瘤能量代謝的基本特征。乳酸是糖酵解過(guò)程的主要代謝產(chǎn)物，腫瘤細(xì)胞中過(guò)量產(chǎn)生的乳酸通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)載體(MCT)轉(zhuǎn)運(yùn)至胞外引起微環(huán)境中pH值下降，進(jìn)而增強(qiáng)腫瘤的增殖、侵襲轉(zhuǎn)移和血管生成。CD147是一種在多種腫瘤細(xì)胞膜上有增高表達(dá)的新型跨膜糖蛋白，在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮與和低pH值微環(huán)境幾乎相同的作用。有研究證實(shí)CD147在腫瘤細(xì)胞膜上與MCT共存并控制其表達(dá)，可能參與乳酸轉(zhuǎn)運(yùn)。
　　 惡性

2、黑素瘤具有生長(zhǎng)速度快、易于發(fā)生轉(zhuǎn)移的特點(diǎn)，是惡性程度較高的皮膚腫瘤之一，其皮損外周的pH值在6.4-7.3之間，低于正常皮膚pH值。同時(shí)惡性黑素瘤細(xì)胞的侵襲和肺轉(zhuǎn)移能力在低pH環(huán)境中明顯增強(qiáng)。因此，本研究旨在明確CD147分子是否與MCT分子共同參與惡性黑素瘤細(xì)胞能量代謝，為CD147分子成為皮膚腫瘤基因治療的靶分子提供更堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。
　　 研究目的：
　　 1.探討CD147分子是否參與了惡性黑素瘤細(xì)胞糖酵解轉(zhuǎn)運(yùn)。

3、
　　 2.探討CD147分子參與糖酵解的機(jī)制。
　　 3.探討CD147分子參與糖酵解過(guò)程的后續(xù)作用。
　　 研究方法
　　 1.運(yùn)用免疫印跡方法檢測(cè)正常黑素細(xì)胞NHMC，惡性黑素瘤細(xì)胞株A375中CD147，MCT1和MCT4的表達(dá)水平。
　　 2.運(yùn)用免疫熒光共聚焦顯微技術(shù)觀察A375細(xì)胞上CD147分別和MCT1、MCT4的表達(dá)共存情況。
　　 3.利用pSUPER/CD147si

4、RNA重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染惡性黑素瘤細(xì)胞株A375。
　　 4.運(yùn)用免疫印跡法觀察CD147 siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)A375細(xì)胞中MCT1和MCT4表達(dá)的影響。
　　 5.運(yùn)用免疫熒光共聚焦顯微技術(shù)觀察CD147 siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)A375細(xì)胞膜上MCT1和MCT4的表達(dá)及其與CD147共存的影響。
　　 6.應(yīng)用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)CD147 siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)A375細(xì)胞糖酵解過(guò)程中乳酸轉(zhuǎn)運(yùn)的影響。
　　 7.應(yīng)用Sar

5、torius pH計(jì)測(cè)定CD147 siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)A375細(xì)胞外微環(huán)境中pH值的影響。
　　 8.運(yùn)用熒光素-熒光素酶方法檢測(cè)CD147 siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)A375細(xì)胞中ATP水平的影響。
　　 9.運(yùn)用MTT方法、Transwell小室和ELISA方法細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)常規(guī)法分別觀察CD147 siRNA以及外源性乳酸對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、VEGF表達(dá)的影響。
　　 研究結(jié)果：
　　 1.正常黑素細(xì)

6、胞NHMC中未檢測(cè)到CD147、MCT1和MCT4的表達(dá)，而惡性黑素瘤細(xì)胞株A375中CD147，MCT1和MCT4有明顯表達(dá)。
　　 2.A375細(xì)胞中CD147分子分別與MCT1、MCT4在細(xì)胞膜上表達(dá)共存。
　　 3.成功構(gòu)建了A375細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pSUPER/CD147siRNA重組質(zhì)粒后的細(xì)胞克隆C1和C2，pSUPER-vector空轉(zhuǎn)為對(duì)照。
　　 4.與A375細(xì)胞比較，C1和C2細(xì)胞胞漿和胞膜上

7、的MCT1、MCT4分子表達(dá)均顯著下降，且與CD147在胞膜上的共表達(dá)下調(diào)。
　　 5.NHMC細(xì)胞培養(yǎng)上清中幾乎未檢測(cè)到乳酸，而A375細(xì)胞培養(yǎng)上清中有顯著增高的乳酸產(chǎn)生。與A375細(xì)胞比較，C1和C2細(xì)胞外微環(huán)境中乳酸水平顯著下降至27.2％和22.4％，而pSUPER-vector空轉(zhuǎn)組細(xì)胞(A375-vector)外乳酸水平無(wú)明顯變化。
　　 6.A375細(xì)胞外pH值為7.19左右，顯著低于NHMC細(xì)胞外水平(p

8、＜0.001)。CD147siRNA干擾了CD147的表達(dá)后，其胞外pH值增高，C1和C2細(xì)胞中分別約為7.36和7.34。
　　 7.與A375細(xì)胞比較，C1和C2細(xì)胞內(nèi)ATP的水平顯著下降，分別下降到了60.8％和51.9％(p＜0.001)。而pSUPER-vector空轉(zhuǎn)組細(xì)胞(A375-vector)內(nèi)的ATP水平與A375細(xì)胞相比無(wú)顯著性差異。
　　 8.與A375細(xì)胞比較，C1和C2細(xì)胞的增殖能力、侵襲能力

9、以及VEGF的表達(dá)水平均顯著下降。但C1和C2細(xì)胞中加入了20mM外源性乳酸后，其增殖能力、侵襲能力以及VEGF的表達(dá)水平均有一定程度的恢復(fù)。
　　 結(jié)論：
　　 1.CD147分子增強(qiáng)了惡性黑素瘤細(xì)胞的糖酵解能力。
　　 2.CD147分子可能通過(guò)影響惡性黑素瘤細(xì)胞中MCT1和MCT4在細(xì)胞膜上的表達(dá)而參與腫瘤細(xì)胞的乳酸轉(zhuǎn)運(yùn)。
　　 3.CD147分子可能通過(guò)下調(diào)腫瘤細(xì)胞外pH值影響惡性黑素瘤細(xì)胞增殖、