1、熱休克蛋白70(HSP70)作為一種重要的伴隨細胞蛋白，能夠參與細胞修復和抗應激活動，對于細胞健康至關重要，同時它還是引導抗原進入MHCI類途徑進而引發(fā)細胞免疫的“細胞因子”和在異體間傳遞抗病毒和腫瘤細胞免疫力的重要介質，為細胞內(nèi)病毒感染及腫瘤的預防和治療提供了可貴的解決途徑，正為動植物醫(yī)學和人類醫(yī)學基礎研究人員所熱切關注，成為當前免疫學研究領域的一個新的熱點。 關于禽類熱休克蛋白的研究文獻極少，其中關于鵝的則尚未報道。禽類的M

2、HC和哺乳動物的MHC有很多差異，禽類HSP70是否能夠參與對病毒的特異性免疫的問題，至今還沒有統(tǒng)一的結論，禽HSP70和抗熱應激及抗病毒感染的關系還有待探討。 為研究HSP70在熱應激的特異性表達，組織中HSP70的分離純化及其結合抗原肽形成復合物的特性，設計此試驗。選取6w的健康五龍鵝隨機分為三組，第1組(對照組)鵝不經(jīng)熱處理后宰殺，第2組(試驗1組)鵝進行1次43±1℃、5h的急性熱處理后立即宰殺，第3組(試驗2組)鵝進行

3、1次43±1℃、5h的急性熱處理后，在正常飼養(yǎng)條件下恢復12h后宰殺。取血液，檢測血清中多種酶的活性以及多種離子濃度的變化；取心臟，做常規(guī)石蠟切片，以SP免疫組化法檢測HSP70的表達；肝臟速凍后以備HSP70蛋白提純之用。比較3組鵝心臟HSP70表達的差異，同時對試驗組肝臟中的HSP70進行分離純化，并進行鑒定。純化后的HSP70和人工合成的乙肝病毒(HBV)前S1多肽在體外相結合形成復合物，設計雙特異抗體夾心法檢測其復合物的形成。

4、 研究結果表明： 1.熱應激前后血漿中多種生理生化指標的變化，反映了熱應激對于機體的嚴重影響。高熱對多種血漿酶活力有明顯的影響，導致GPT、AKP、LDH活性分別對照下降42.37％，32.85％和26.25％，差異極顯著(p＜0.01)，ACP活性對照下降20.00％，差異顯著(p＜0.05)，GOT活性兩組差異不顯著(p＞0.05)；熱應激對于血漿中多種離子濃度的含量亦有明顯的影響，致使Ca、P、Na和K濃度分別對照下

5、降22.04％，13.19％，20.72％和30.91％，差異均顯著(p＜0.05)；血漿pH值差異不顯著(p＞0.05)，但從數(shù)值上看有所上升，血液的堿性增加。 2.通過免疫紐化法檢測對照組和試驗紐心臟切片中HSP70的表達，發(fā)現(xiàn)正常情況下五龍鵝心肌組織中HSP70表達為陰性，陽性細胞率僅為0.6％；而熱應激狀態(tài)下心肌纖維中有廣泛的HSP70陽性顆粒，血管壁上陽性顆粒尤為明顯：應激后立即宰殺紐中HSP70表達重點部位在核膜及其

6、周圍，陽性顆粒聚集成團塊狀或絮狀，陽性細胞率為76.0％，而恢復12h后的鵝只其心肌HSP70表達重點轉移到胞膜周圍，陽性顆粒聚集呈長條狀，陽性細胞率為88.4％。兩個試驗組之間的陽性細胞率差異不顯著(p＞0.05)，但試驗2組的陽性細胞率相對要高。本試驗暗示著HSP70和保護細胞免受應激傷害可能有著密切的聯(lián)系。 3.本試驗中自行設計了兩套低值高效的低壓層析流程，首次嘗試從成分復雜的鵝肝組織中分離純化HSP70，并對參考文獻所述

7、方法進行了完善和改進，摒棄了傳統(tǒng)純化方式的高等儀器依賴性，改善其普及性。通過SephacrylS-300初步分離，ConA-Agarose親和層析和DEAE離子交換層析的方式純化蛋白得到HSP70純化物，純度達85％以上，蛋白得率為0.115mg/g；通過SephacrylS-300初步分離，ConA-Agrose和ADP-Agarose親和層析能得到目的蛋白純化物，純度達95％，蛋白得率為0.157mg/g；兩種方式均可有效分離目的蛋

8、白，相比較而言，SephacrylS-300初步分離，ConA-Agrose和ADP-Agarose親和層析這套流程效果更好。WesternBlot證明兩種方式所得蛋白均為HSP70。 4.人工合成HBV的PreS1抗原中的主要抗原決定簇，作為半抗原和一定載體蛋白相結合后免疫家兔，制備半抗原的特異性抗體；同時，合成肽在一定條件下與純化所得的HSP70在體外形成復合物，經(jīng)所制備的多肽抗體和商品HSP70多克隆抗體通過雙特異性抗體夾