1、研究背景：
　　 艾滋病作為當(dāng)今世界影響重大的流行性疾病,也是當(dāng)前人類(lèi)健康面臨重大威脅的疾病。但是,一直以來(lái)缺乏有效的治療藥物和疫苗。人類(lèi)免疫缺陷病毒為 Ⅰ型包膜病毒,采用病毒宿主細(xì)胞膜融合機(jī)制。病毒表面糖蛋白結(jié)合到宿主細(xì)胞受體后,啟動(dòng)病毒融合蛋白的一系列構(gòu)象變化。包膜病毒進(jìn)入靶細(xì)胞的過(guò)程需要病毒膜糖蛋白的介導(dǎo),這一類(lèi)型病毒的包膜蛋白一般都包括兩個(gè)亞基,不跨膜的亞基(如HIV的gp120)能夠與靶細(xì)胞膜上病毒受體相結(jié)合,跨膜的亞

2、基(如HIV的gp41)介導(dǎo)病毒膜與靶細(xì)胞膜進(jìn)行融合。因此可以據(jù)此來(lái)設(shè)計(jì)抑制劑,阻止包膜糖蛋白的進(jìn)一步折疊,抑制病毒的入侵,為病毒性疾病的預(yù)防和治療提供新的思路和策略。
　　 HIV是一種感染人類(lèi)免疫系統(tǒng)細(xì)胞的慢病毒,靶細(xì)胞是CD4陽(yáng)性T淋巴細(xì)胞。HIV 能夠特征性地引起CD4陽(yáng)性T淋巴細(xì)胞逐漸減少和免疫缺陷,最后導(dǎo)致獲得性免疫缺陷綜合征即艾滋病。艾滋病能夠引起機(jī)會(huì)性感染并最終導(dǎo)致死亡。病毒與宿主免疫細(xì)胞的相互作用是影響疾病發(fā)展

3、的關(guān)鍵因素。在HIV感染導(dǎo)致的AIDS疾病進(jìn)展過(guò)程中,T細(xì)胞活化是一把雙刃劍。CD4陽(yáng)性T淋巴細(xì)胞的活化在清除病毒的過(guò)程中是非常關(guān)鍵的,成熟的CD4陽(yáng)性T淋巴細(xì)胞是宿主抗病毒免疫的關(guān)鍵因素。HIV包膜蛋白gp120能夠結(jié)合CD4陽(yáng)性T淋巴細(xì)胞受體,進(jìn)入細(xì)胞后進(jìn)行復(fù)制,由于病毒顆粒的持續(xù)表達(dá),CD4陽(yáng)性T淋巴細(xì)胞增殖增加。CD4陽(yáng)性T淋巴細(xì)胞活化后又可借助自身表達(dá)的凋亡受體,使已發(fā)生增殖的CD4陽(yáng)性T淋巴細(xì)胞發(fā)生自身凋亡。因此,適度的CD

4、4陽(yáng)性T淋巴細(xì)胞活化可能作為HIV治療的一種方法和策略。有文獻(xiàn)報(bào)道從人血液透析液中分離的小分了多肽及其衍生物能夠與HIV的融合多肽特異性結(jié)合并抑制HIV包膜蛋白介導(dǎo)的病毒進(jìn)入過(guò)程。融合多肽作為HIV的組成多肽除了與病毒進(jìn)入密切相關(guān),還能夠直接影響免疫細(xì)胞如CD4陽(yáng)性T淋巴細(xì)胞的活化。
　　 目的：比較天然活性產(chǎn)物淫羊藿素與經(jīng)典免疫抑制劑環(huán)孢素A對(duì)T細(xì)胞亞群的影響。觀察常用絲裂原ConA對(duì)CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞抑制功能的影

5、響與早期活化標(biāo)志CD69之間的關(guān)系。研究HIV病毒包膜蛋白gp41的融合多肽對(duì)非抗原特異性和抗原特異性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的影響。
　　 方法:無(wú)菌分離出小鼠脾臟,紅細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞,標(biāo)記好 CFSE 染料的細(xì)胞3×105 每孔種植于96孔板中,研究 OVA的T 細(xì)胞增殖以及藥物淫羊藿素 Icaritin的作用,流式細(xì)胞儀檢測(cè)。細(xì)胞采用直接免疫熒光標(biāo)記法對(duì)每組細(xì)胞進(jìn)行染色,分析藥物淫羊藿素 Icaritin 對(duì) CD4 陽(yáng)性T 細(xì)胞表

6、面標(biāo)志 IL-2 受體CD25的表達(dá)。研究 CD4 陽(yáng)性T細(xì)胞表面標(biāo)志IL-2受體CD25的表達(dá)以及藥物淫羊藿素:Icaritin的作用,流式細(xì)胞儀檢測(cè)。ELISA 檢測(cè)IL-2的分泌。用免疫磁珠分離 BALB/c小鼠脾臟 CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞、CD4+CD25-效應(yīng)性T細(xì)胞,加入不同濃度的ConA,12h 后收集細(xì)胞,流式細(xì)胞分析其 CD69的表達(dá)。CFSE 標(biāo)記 CD4+CD25-效應(yīng)性T細(xì)胞,按2:1比例與CD4+CD

7、25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞共同培養(yǎng),培養(yǎng)同時(shí)加 ConA,3d后流式細(xì)胞儀分析ConA對(duì)CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞抑制CD4+CD25-效應(yīng)性T 細(xì)胞增殖的影響。流式細(xì)胞儀檢測(cè)HIV病毒包膜蛋白gp41的融合多肽FP對(duì)ConA及PDB刺激的非抗原特異性和OVA抗原刺激的抗原特異性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的早期活化表面分子標(biāo)志CD69的影響。
　　 結(jié)果:通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)淫羊藿素能抑制小鼠 T 細(xì)胞增殖和CD4陽(yáng)性T細(xì)胞增殖。淫羊藿素能抑制

8、CD4陽(yáng)性T 細(xì)胞 IL-2 受體 CD25的表達(dá),同時(shí)也能抑制 T 細(xì)胞分泌 IL-2。通過(guò) ConA 能劑量依賴(lài)性地升高 CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和CD4+CD25-效應(yīng)性T細(xì)胞CD69的表達(dá),對(duì)兩群細(xì)胞CD69的升高表現(xiàn)出了相似的作用:另外,ConA在上述濃度能劑量依賴(lài)激活CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的抑制功能。HIV 病毒包膜蛋白gp41的融合多肽FP升高OVA抗原刺激的抗原特異性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的早期活化表面分子標(biāo)志CD6

9、9,對(duì)ConA及PDB刺激的非抗原特異性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的早期活化表面分子標(biāo)志CD69則沒(méi)有影響。
　　 結(jié)論:天然活性產(chǎn)物淫羊藿素具有免疫抑制功能。ConA 在體外對(duì) CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞活化和功能具有促進(jìn)作用。ConA 能一定程度模擬抗原,因而可用于評(píng)價(jià)藥物對(duì)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的活化和功能影響。HIV 包膜蛋白gp41 融合多肽 FP不影響非抗原特異性調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞的功能,但是能夠激活抗原特異性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞抑制效應(yīng)性T細(xì)胞