1、近年來(lái)，HIV病毒在全球范圍內(nèi)呈現(xiàn)快速流行態(tài)勢(shì)。HIV抗體診斷試劑作為目前初步診斷HIV的主要方法，具有巨大的市場(chǎng)價(jià)值。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，利用基因工程的手段，制備具有良好免疫反應(yīng)性的HIV-1 gp41重組抗原原料，對(duì)于HIV抗體診斷試劑的研發(fā)有著深遠(yuǎn)意義。
　　本文首先合成了經(jīng)過(guò)密碼子優(yōu)化的gp41基因質(zhì)粒模板pET-28a(+)-gp41，PCR擴(kuò)增獲得了包含gp41主要優(yōu)勢(shì)抗原表位以及膜外重要結(jié)構(gòu)域(NHR、CHR、MPE

2、R)的截短基因序列。通過(guò)在gp41截短片段上游添加親水性分子伴侶DsbA，在大腸桿菌體內(nèi)實(shí)現(xiàn)了gp41優(yōu)勢(shì)抗原表位蛋白的融合表達(dá)。在優(yōu)化表達(dá)條件下（37℃，0.2 mM IPTG，誘導(dǎo)后培養(yǎng)時(shí)間10h），融合蛋白表達(dá)水平為8.7μg/mL。
　　鑒于gp41融合蛋白在大腸桿菌體內(nèi)表達(dá)的水平較低，無(wú)法滿(mǎn)足制備gp41抗原的要求，本研究進(jìn)而利用大腸桿菌體外無(wú)細(xì)胞體系表達(dá)gp41蛋白。利用PCR克隆gp41全長(zhǎng)基因，成功構(gòu)建無(wú)細(xì)胞表達(dá)重

3、組質(zhì)粒pIVEX2.4c-gp41，在大腸桿菌無(wú)細(xì)胞體系中實(shí)現(xiàn)了gp41全長(zhǎng)蛋白的表達(dá)。進(jìn)一步考察去污劑重懸目標(biāo)蛋白和直接在無(wú)細(xì)胞體系中添加去污劑兩種模式對(duì)獲得可溶gp41蛋白的影響。結(jié)果顯示，所嘗試的各種去污劑均不能有效重懸gp41蛋白沉淀;而直接添加去污劑模式在最優(yōu)條件下（添加終濃度為0.2％的Brij78），可溶gp41蛋白的表達(dá)水平達(dá)到650μg/mL。
　　對(duì)添加去污劑模式所表達(dá)的可溶gp41重組蛋白進(jìn)行純化、濃縮和替換

4、緩沖液，蛋白純度達(dá)到95.6％，濃度為1.5 mg/mL，總回收率為70％。利用純化后的gp41重組蛋白制備乳膠法免疫層析試紙，通過(guò)對(duì)不同抗體滴度HIV-1陽(yáng)性標(biāo)本、HIV-1陰性標(biāo)本、TP陽(yáng)性標(biāo)本以及HBeAb陽(yáng)性標(biāo)本的檢測(cè)，證明該gp41重組蛋白免疫反應(yīng)性良好。
　　總之，本文致力于HIV-1 gp41在大腸桿菌體內(nèi)和體外無(wú)細(xì)胞體系的重組表達(dá)研究。通過(guò)對(duì)無(wú)細(xì)胞表達(dá)體系的優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)了gp41的全長(zhǎng)可溶表達(dá)，親和純化獲得的目標(biāo)蛋白