1、生物素(vitaminH)是一種含硫維生素，是動(dòng)物機(jī)體維持正常生理機(jī)能所必需的B族維生素之一，隨著生物素缺乏癥在多種養(yǎng)殖動(dòng)物中的出現(xiàn)，人們已經(jīng)對(duì)生物素的營(yíng)養(yǎng)生理功能有了全新的認(rèn)識(shí)，并使其成為最受重視的水溶性維生素之一。生物素在畜牧業(yè)、分子生物學(xué)、生物發(fā)酵及醫(yī)藥行業(yè)等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。生物素不能直接從自然界獲得，而我國(guó)所用的生物素均從日本、美國(guó)等國(guó)家進(jìn)口，且價(jià)格昂貴，因此，進(jìn)行生物素合成的研究是非常必要的。目前，利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)生物素是國(guó)

2、際上高技術(shù)競(jìng)爭(zhēng)的又一熱點(diǎn)。 枯草芽孢桿菌為革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，細(xì)胞壁不含內(nèi)毒素，能分泌大量蛋白到體外，為一些重要工業(yè)酶制劑的生產(chǎn)菌種。而影響克隆基因表達(dá)效率的因素有2個(gè)：第一是啟動(dòng)子的強(qiáng)度；第二是基因的拷貝數(shù)，但由于其在枯草桿菌中存在分離復(fù)制的不穩(wěn)定及外源基因的克隆表達(dá)效率低的現(xiàn)象，將外源目的基因整合到染色體上復(fù)制表達(dá)是解決染色體外復(fù)制質(zhì)粒在宿主中遺傳不穩(wěn)定現(xiàn)象的有效策略。因此本研究以枯草芽孢桿菌1A747菌株為研究材料，通過(guò)同源重

3、組，將強(qiáng)的啟動(dòng)子pglv以及Cm基因整合到枯草桿菌染色體上，增加生物素操縱元基因的拷貝數(shù)，對(duì)其進(jìn)行功能表達(dá)及檢測(cè)。 設(shè)計(jì)引物以PCR方式擴(kuò)枯草桿菌生物素操縱元基因bioWAFDB，得到整合載體YG50，根據(jù)這五個(gè)基因同源于與枯草桿菌1A747，通過(guò)單交叉整合方式將質(zhì)粒YG50滾環(huán)式全部帶入1A747染色體基因組，得到單交叉整合菌BI1。分別用五對(duì)引物，即intedia-1，intedia-2，bioW-bioB，bioB-bio

4、W，Spec-bioF，PCR擴(kuò)增法鑒定整合菌BI1。 設(shè)計(jì)引物Con-up和Con-down，以T載體為模板，PCR擴(kuò)增出Con片斷，從TA克隆的質(zhì)粒BL46上用限制性內(nèi)切酶KpnI和ApaI消化，與相同酶切消化回收的E3骨架連接，得到質(zhì)粒BL57。設(shè)計(jì)引物Cm-up和Cm-down，以PDL為模板，PCR擴(kuò)增出Cm基因，用限制性內(nèi)切酶ApaI和BamHI消化TA克隆的質(zhì)粒BL47，與相同酶切消化回收的BL57載體連接，得到質(zhì)

5、粒BL59。同樣設(shè)計(jì)引物pglvW-up和pglvW-down，從實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建好的質(zhì)粒QJ34上PCR擴(kuò)增出啟動(dòng)子pglv與bioW基因，TA克隆的質(zhì)粒為BL48，用限制性內(nèi)切酶BamHI和SacI消化，與相同方式酶切消化回收的E3骨架連接，得到質(zhì)粒BL56。再用限制性內(nèi)切酶KpnI和BamHI消化BL59，回收Con片斷和Cm基因，用相同的酶消化回收的BL56載體連接，得到最終的雙交叉載體BL60。 用限制性內(nèi)切酶ScaI線性

6、化質(zhì)粒BL60，由于Con片斷和bioW基因分別同源于單交叉整合菌BI1染色體上的同名基因，因此，它們之間的Cm基因和pglv啟動(dòng)子通過(guò)雙交叉整合方式替換掉枯草桿菌BI1原來(lái)染色體上的Spec抗性基因和Pbio啟動(dòng)子，得到整合菌BI2，通過(guò)PCR擴(kuò)增方式初篩。從Cm5μg/ml逐漸提高Cm抗性濃度到80μg/ml，BI2可正常生長(zhǎng)，通過(guò)Southernblotting可檢測(cè)到5～15個(gè)拷貝數(shù)。通過(guò)微生物法和高效液相色譜法測(cè)定了生物素的表