1、慢性心力衰竭(CHF，chronic heart failure)是一組復雜的臨床綜合征，是各種病因導致心血管疾病的嚴重階段。隨著人口老齡化和醫(yī)療救治技術提高，心力衰竭患病率逐年增加，正在成為我國21世紀的重要公共衛(wèi)生問題。慢性心力衰竭是一種進展性疾病，一旦發(fā)生即使去除病因，仍可通過心室重構不斷發(fā)展。雖然近十余年來心衰的治療策略得到明顯改進，但其預后仍然很差，5年病死率仍與惡性腫瘤相仿。因此研究心力衰竭的發(fā)病機制，探索新的治療靶點，成為

2、心力衰竭的主要研究方向。心力衰竭的心肌代謝重構是近年來的研究熱點之一。所謂代謝重構(metabolic remodeling)是指心力衰竭時，心肌細胞底物利用以及能量代謝紊亂的現象。研究表明在心衰發(fā)生發(fā)展的過程中，衰竭的心肌往往發(fā)生了能量代謝和底物利用的改變。這些代謝改變反映出衰竭心肌對能量需求增加，以及ATP合成利用能力受到了損害。大量臨床與實驗證據表明底物利用障礙和能量物質缺乏可能是導致心肌重構和慢性心衰進展的重要原因，對心衰心臟進

3、行代謝干預可改善心臟功能。然而如何檢測心肌能量代謝是心力衰竭代謝治療需要面臨的關鍵問題?，F有的檢測心肌代謝的方法主要是PET、MRI等影像學方法，但是這些方法操作復雜、設備昂貴，難以在臨床推廣應用。我們已經在前期的研究中建立了超聲心動圖評價心肌能量消耗(MEE)的方法。本研究中我們擬通過代謝組學技術檢測心衰患者的血清代謝譜，分析其與超聲心肌能耗指標MEE相關性，探討血清代謝組學方法評價心衰心肌代謝重構的可行性。并在此基礎上篩選能夠客觀、

4、準確反映心肌能量代謝的血清生物標志物，從而建立一種實用、簡便、經濟、有效的評價心臟能量代謝的血清學方法。并希望通過這樣一些標志代謝物，探討心衰能量代謝障礙的發(fā)生機制，為發(fā)現新的心衰治療靶點提供線索。本研究共分三個部分:
　　 第一章：基于1H-NMR代謝組學方法在慢性心力衰竭中的應用
　　 代謝是生命活動的本質和物質基礎，任何生命運動均離不開代謝。當機體受到外源性因素（如藥物、毒物等）或內源性因素（代謝障礙、病理生理改變

5、）影響時，在細胞、組織，甚至整體水平會發(fā)生代謝的變化應答，導致體液代謝物種類和濃度的變化。代謝組學通過檢測代謝物水平的整體和動態(tài)變化，建立適當的分類模型，提取相關的生物代謝標志物簇(biomarker clusters)，幫助明確診斷及了解疾病發(fā)病過程。我們在本章中利用代謝組學方法，通過研究代謝物圖譜隨時間的變化，分析心力衰竭過程中整體功能的完整信息，驗證這一技術方法在慢性心力衰竭中應用的可行性。
　　 材料與方法:本研究共納入

6、研究對象61人。其中男性43人，女性18人，平均年齡61.5歲。其中正常對照組15人;心力衰竭組46人，其中NYHA心功能分級Ⅱ級者11例，Ⅲ級者18例，Ⅳ級者17例。采血前要求空腹8小時，1周內未飲濃茶、咖啡等飲料。所采血液室溫下自然凝固1h，收集血清，4℃3000g離心10min，收集上層血清，置-80℃冷凍保存。檢測儀器采用美國瓦里安公司(Varian，Inc.)的INOVA600MHz超導核磁共振譜儀，配備脈沖場梯度，帶梯度場的

7、三共振探頭。檢測前將凍干處理過的血清樣本在室溫下解凍。向離心管中分別依次加入100μlTSP重水溶液(1mg/ml)，300μl血清以及200μl重水(D2O)，充分震蕩混勻后，13,000g離心10min。取550μl上清加入5mm核磁共振管中待用，當樣本全部溶解呈勻質透明時，分別采用馳豫編輯脈沖序列(CPMG)和擴散編輯脈沖序列(LED)采集血清樣本的數據。對所得NMR數據經傅立葉變換得到譜圖，然后調整相位并進行基線校正。對CPMG

8、數據，將0.4～4.4范圍內的譜按照每段0.01ppm進行分段積分;對LED數據，將0～6.0范圍內的譜按照每段0.04ppm進行分段積分，并將4.6～5.0之間的譜排除。將積分按每張譜的總積分強度歸一化。所得數據輸出并轉換到Excel文件保存。我們采用SIMCA-P+軟件(v11.5，Umetrics，Ume(a),Sweden)進行多元統(tǒng)計分析。分析前先對數據進行平均中心化和自動標度化處理。采用主成分分析法(PCA)建立判別模型。對

9、數據進行正交信號校正處理（orthogonal signal correction，OSC）。然后采用偏最小二乘法(partial least square，PLS)進行回歸分析。
　　 結果:1、對照組與心衰組典型血清1H-NMR圖譜顯示兩者血清代謝譜在δ0.84～0.90ppm，δ1.26～1.30ppm，δ1.32～1.33ppm,δ4.09～4.10ppm,δ2.22ppm,δ3.40～4.00ppm,δ1.19～1.2

10、0ppm和δ1.46～1.48ppm等多個化學位移的波峰大小有顯著差異。經過譜峰歸屬后結果表明心衰組血清中的脂蛋白及糖基化合物的相對含量比對照組高，而丙氨酸等有機酸含量則較對照組低;2、PCA分析表明，對照組與EF＜40％心力衰竭組血清代謝組區(qū)別最為顯著，而另外兩組則不易區(qū)分;3、用OSC-PLS方法后上述3組兩兩間分離效果顯著改善;4、采用交叉驗證和分類變量交換法進行驗證，上述方法建立的分類模型準確度和預測度超過85％，模型穩(wěn)健可靠，

11、可以用來做進一步分析;5、用變量重要性排序(variable importance in projection，VIP)值，載荷權重(loading weights)和相關系數（correlation coefficients）等方法篩選差異代謝物，結果基本一致。
　　 結論:1、正常對照組與EF＜40％心力衰竭組血清代謝組存在顯著差異，而40％＜EF＜50％心力衰竭組與正常組差別則不明顯;2、基于1H-NMR的技術結合正交信號

12、校正的PLS方法能夠識別各組之間血清代謝組差異，顯著改善分離效果;3、經過多種驗證方法證明，OPLS方法建立的分類模型準確度和預測度均很高，模型穩(wěn)定可靠;4、不同方法篩選的差異代謝物基本一致。
　　 第二章：運用代謝組學方法評價心肌代謝重構及血清標志物篩選
　　 我們在第一章中已經證明，利用基于1H-NMR的代謝組學方法能夠檢測出EF＜40％心力衰竭患者的血清代謝組相對于正常人已經發(fā)生了顯著改變。在本章中，我們繼續(xù)利用1

13、H-NMR的代謝組學方法研究不同心肌能量消耗水平血清代謝組是否有差異。并以此為基礎篩選能夠代表心肌能量消耗的生物標記物，為客觀定量評價心肌代謝重構提供重要診斷工具，進而為研究心衰發(fā)生發(fā)展的代謝機制提供線索。
　　 材料與方法:研究對象與血清代謝組學檢測方法同第一章。用我們前期已經建立的超聲心動圖方法測量入選者的心肌能量消耗(MEE)。以MEE為分類變量建立OPLS模型。
　　 結果:1、PCA顯示高MEE組與低MEE組血

14、清代謝組之間區(qū)別顯著;2、建立關于MEE的PLS模型發(fā)現，經過正交信號校正后PLS模型分離效果最佳，模型準確度和預測度均超過90％，驗證結果表明模型穩(wěn)定可靠;3、以變量重要性排序(VIP)值為篩選標準，選取VIP值大于1的變量，共歸屬出18種代謝物。再進一步用oneway-ANONA統(tǒng)計方法比較了各組代謝物水平差異，排除了三組間濃度無顯著差異的代謝物，篩選出了3-羥基丁酸（3-Hydroxybutyrate）、丙酮(Acetone)、琥

15、珀酸(Succinate)、纈氨酸(Valine)、丙氨酸(Alanine)、谷氨酰胺（Glutamine）、甲硫胺酸(Methionine)、肌酸(Creatine)等8種代謝物為血清標志物;4、其中丙酮、3-羥基丁酸、琥珀酸與MEE呈正相關(r=0.451，0.452，0.508);谷氨酰胺、纈氨酸、丙氨酸、甲硫胺酸與MEE呈負相關(r=-0.257，-0.260，-0.475，-0.420)。篩選出的代謝物水平與患者是否使用ACE

16、I等藥物無關。與傳統(tǒng)心力衰竭危險因素相關分析表明，丙酮、3-羥基丁酸、琥珀酸與腦鈉肽、肌酐、心率呈正相關(P＜0.01，P＜0.01，P＜0.05);丙氨酸、甲硫氨酸與腦鈉肽(BNP)、心率則呈負相關(P＜0.01，P＜0.01)。甲硫氨酸與血糖呈負相關(P＜0.05)。年齡、體質指數(BMI)、血清總膽固醇、甘油三酯以及尿酸與上述代謝物相關不明顯;5、受試者特征曲線(ROC)表明，腦鈉肽、丙酮、3-羥基丁酸、琥珀酸的AUC分別為0.9

17、8、0.92、0.90、0.86。丙酮診斷慢性心力衰竭，敏感度達89.13％，特異度達80％。3-羥基丁酸診斷敏感度達89.13％，特異度達93.33％。
　　 結論:1、不同MEE組的血清代謝組存在顯著差異，通過代謝組學方法可以有效進行區(qū)分，其中以低MEE組和高MEE組間區(qū)別最為顯著。2、篩選出與心肌能量消耗相關的8種代謝物，包括3-羥基丁酸(3-Hydroxybutyrate)、丙酮(Acetone)、琥珀酸(Succina

18、te)（以上呈正相關）;纈氨酸(Valine)、丙氨酸(Alanine)、谷氨酰胺（Glutamine）、甲硫胺酸(Methionine)（以上呈負相關）;中度MEE時升高，高MEE時反而減少的代謝物，肌酸(Creatine);3.丙酮、3-羥基丁酸可作為慢性心力衰竭的小分子血清標志物。
　　 第三章：基于GC/MS的大鼠心力衰竭模型血清代謝組學研究
　　 臨床上慢性心力衰竭病人個體差異比較大，加上很難完全去除飲食、情緒

19、等因素的干擾，容易使研究結果發(fā)生誤差。因此我們在第三章中采用目前常用的冠狀動脈結扎法模擬缺血性心力衰竭發(fā)病過程，用基于GC/MS的技術方法，以進一步研究心力衰竭大鼠與對照組血清代謝組學差異，為上述結果提供實驗證據。
　　 材料與方法:SPF級SD雄性大鼠51只，體質量200-300g。隨機分為假手術組16只和冠狀動脈結扎組35只。用冠狀動脈結扎法制備慢性缺血性心力衰竭模型。4周后，在麻醉狀態(tài)下，切開腹部，用真空取血管快速從下腔靜

20、脈抽取靜脈血。靜置10分鐘左右，離心后提取血漿，用于血清代謝組學分析。代謝組學檢測采用Agilent 7890A GC/5975C MS系統(tǒng)，毛細管色譜柱為Agilent J&W Scientific公司的HP-5MS(30m×250μmi.d.)。檢測前樣品管內加入120μl色譜甲醇，離心取120μl上清液至高回收率樣品瓶中，溫和氮氣吹干，加入80μl的15mg/ml甲氧胺吡啶溶液，然后加入80μlBSTFA試劑（含1％TMCS），7

21、0℃下反應60分鐘后進行GC/MS分析。采用全掃描形式進行質譜檢測，質譜檢測范圍為50-600(m/z)。在R軟件平臺下采用自寫的程序代碼提取原始數據信號，然后導入TagFinder軟件進行質譜碎片的保留時間校正、峰對齊和反卷積分析，最后在EXCEL軟件中進行后期編輯。數據導入Simca-P軟件（版本11.5）分別進行主成分分析(PCA)、偏最小二乘方判別分析(PLS-DA)和正交偏最小二乘方判別分析(OPLS-DA)。
　　

22、結果:1、假手術組16只，存活14只，總存活率87.5％。冠狀動脈結扎組35只，存活18只，總存活率51.4％。手術組射血分數（LVEF）顯著小于假手術組(47％vs76％，P=0.001)。2、PCA得分圖顯示，重度心衰組與輕度心衰組和對照組之間均有顯著差異，但是輕度心衰組與對照組之間無顯著差異。3、可以建立穩(wěn)定可靠的OPLS-DA模型，并篩選出44種差異代謝物。
　　 結論:1、重度心力衰竭的血清代謝組和正常相比發(fā)生顯著變化