1、背景：涎腺腺樣囊性癌（salivary adenoid cystic carcinoma，SACC）是最常見的涎腺惡性腫瘤之一，其生物學(xué)性狀主要是易發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移部位以肺為多見，預(yù)后較差，也是導(dǎo)致患者死亡的主要原因。遠處轉(zhuǎn)移是影響涎腺腺樣囊性癌患者預(yù)后的重要因素。
　　 過氧化物增殖體激活物受體(peroxisome proliferators activated receptors，PPAR)是最新發(fā)現(xiàn)的一組核激素受體超家

2、族成員。人類的PPAR有三種亞型：PPARα、PPARδ（亦稱PPARβ）及PPARγ。其中，PPARγ是最具脂肪組織特異性的，也是研究最廣泛的一種，在介導(dǎo)脂肪細胞分化和調(diào)節(jié)脂肪代謝中起著重要作用，參與糖尿病、動脈粥樣硬化、炎癥、肥胖等的病理生理過程。PPARγ基因定位于染色體3p25，含有9個外顯子，其基因組結(jié)構(gòu)覆蓋100kb。許多研究表明PPARγ在人體多種器官惡性腫瘤中陽性表達，并且通過細胞抗增殖作用，誘導(dǎo)細胞凋亡和分化等機制，在

3、應(yīng)答于癌細胞的生長刺激的細胞核信號中發(fā)揮抗腫瘤作用。近年來有報道PPARγ配體能夠獨立或通過激活PPARγ抑制多種癌細胞的生長，并已應(yīng)用于肺癌、乳腺癌等一些惡性腫瘤的治療中。
　　 口腔頜面部惡性腫瘤中，腺樣囊性癌(ACC)極易發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移。而轉(zhuǎn)移性和侵襲性是惡性腫瘤的重要特征，腫瘤若失去轉(zhuǎn)移特性其惡性度將大大降低，對腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的研究是攻克腫瘤不可缺少的重要基礎(chǔ)工作之一。PPARγ作為目前研究最成熟的核激素受體，但PPAR

4、γ在SACC細胞中的表達及其與涎腺腺樣囊性癌遠處轉(zhuǎn)移發(fā)生發(fā)展的關(guān)系少見報道。本實驗采用western blot和逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)及實時定量PCR( Quantitative Real-time PCR)方法檢測PPARγ在肺高轉(zhuǎn)移性涎腺腺樣囊性癌(SACC-LM)及肺低轉(zhuǎn)移性涎腺腺樣囊性癌(SACC-83)細胞系中表達水平差異，從而探討PPARγ與涎腺腺樣囊性癌肺轉(zhuǎn)移的關(guān)系，對SACC的轉(zhuǎn)移機制進行科學(xué)研究，探索核激

5、素受體PPARγ與SACC轉(zhuǎn)移的關(guān)系，進一步豐富對SACC轉(zhuǎn)移的研究。
　　 目的：
　　 1.探討過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)在涎腺腺樣囊性癌人肺高轉(zhuǎn)移細胞系SACC-LM與人肺低轉(zhuǎn)移細胞系SACC-83中的表達。
　　 2.觀察過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)在涎腺腺樣囊性癌人肺高、低轉(zhuǎn)移細胞系中的表達差異。
　　 3.探討PPARγ在SACC肺轉(zhuǎn)移中的作用，并探討PPARγ是

6、否與涎腺腺樣囊性癌(SACC)肺轉(zhuǎn)移相關(guān)。
　　 方法：
　　 1.使用western blotting方法，培養(yǎng)細胞漂洗，懸浮，溶解，超聲處理儀剪切DNA，離心，取上清。紫外分光光度計定量。取20-50μg樣本蛋白，常規(guī)SDS-PAGE電泳，然后電轉(zhuǎn)到PVDF膜上。50g/L脫脂奶粉封閉。加入PPARγ抗體(sc-7273，Santa Cruz公司1：200)，4℃孵育過夜，HRP標(biāo)記二抗(1：2000)孵育，PBST

7、洗脫，ECL化學(xué)發(fā)光后檢測目的蛋白濃度，以42kD的β-actin為內(nèi)參照。檢測涎腺腺樣囊性癌人肺高、低轉(zhuǎn)移細胞系中過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）的表達
　　 2.利用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR) Trizol法抽提總RNA，所提取的總RNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，并經(jīng)紫外分光光度計定量。將提取的RNA按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明合成cDNA第1鏈。引物設(shè)計在不同的外顯子上，以避免因基因組DNA的污染所造成的假陽性。PP

8、ARγ引物序列如下：上游引物：5′-ATGGCAATTGAATGTCGTGTC-3'；下游引物：5′-TCCGCCCAAACCTGATG-3′，所用內(nèi)參為gapdh，上游引物：5'-CATCAAGAAGGTGGTGAAGCAG-3′，下游引物：5′-CGTCAAAGGTGGAGGAGTGG-3′。引物由上海生物工程技術(shù)公司進行合成。PCR反應(yīng)在Biometra熱循環(huán)儀中進行。PCR產(chǎn)物行210％瓊脂糖凝膠(含0.125μg/mlEB)電

9、泳鑒定，反映PPARγ mRNA在SACC-83和SACC-LM細胞系中的表達。
　　 實時定量PCR（Quantitative Real-time PCR）方法將PPARγ和GAPDH的PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，割膠回收純化；制成標(biāo)準(zhǔn)品；將上述不同稀釋度的兩種標(biāo)模板及待測樣品以Eva Green作為熒光染料，按以下條件進行檢測，每個樣品做2個平行管以減少誤差。反應(yīng)體系：于PCR管中加入10×Buffer215μ1，dNTP(

10、215mmol/L)，上游引物和下游引物各1μ1，Taq DNA聚合酶0.15μl，DNA模板1μ1，2×Eva（熒光染料）1125μ1，ddH2O至25μl。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性15s;56℃退火20s，72℃延伸30s，循環(huán)40次；對擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳分析特異性，以PPARγ與GAPDH相對濃度的比值來反映PPARγ表達量。以檢測肺高轉(zhuǎn)移性涎腺腺樣囊性癌(SACC-LM)及肺低轉(zhuǎn)移性涎腺腺樣囊性癌（SACC-83）細胞系中

11、PPARγ蛋白表達和PPARγmRNA的表達水平。
　　 結(jié)果：
　　 本實驗觀察到PPARγ蛋白及mRNA在SACC-LM細胞系及SACC-83細胞系中均有表達，與SACC-83細胞系相比，SACC-LM細胞系中PPARγ蛋白較高表達，并且SACC-LM細胞系中PPARγmRNA表達水平是SACC-83細胞中表達水平的4.346939倍(P＜0.01)。
　　 結(jié)論：1、過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ